〔摘要〕 目的 從動情周期、骨密度、骨組織形態結構和原代骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs)生長曲線4個層次判定雌性大鼠手術去勢造模是否成功。方法 30只2月齡SPF級雌性大鼠，隨機平均分為空白組、假手術組和模型組3組。手術去勢造模完成后次日起連續7 d對3組大鼠進行陰道脫落細胞涂片，判斷動情周期。造模后第8天取左側股骨組織做骨密度測定和HE染色，取右側骨組織分離原代BMMSCs。結果 空白組和假手術組動情周期正常，模型組大鼠動情周期紊亂;骨組織HE染色顯示模型組骨小梁稀少且間距加大;與空白組比較，假手術組骨密度和BMMSCs生長速率差異無統計學意義(P>0.05)，與假手術組相比，模型組骨密度顯著降低，BMMSCs生長速率顯著下降，差異具有統計學意義(P<0.01)。結論 造模成功后的雌性大鼠動情周期紊亂，骨密度降低，骨小梁疏松，BMMSCs的生長緩慢，為骨質疏松癥動物模型建立判定提供較全面的依據。
〔關鍵詞〕 去勢雌性大鼠;骨質疏松癥;動物模型;動情周期;骨密度;骨髓間充質干細胞
根據國家統計局調查顯示[1]，我國65歲以上人口接近1.4億(約占總人口的10.1%)，是世界上老年人口絕對數最多的國家。有專家預測[2]，2050年我國用于治療原發性骨質疏松癥性骨折費用將達1 630億元。隨著人口老齡化趨勢的日益加重，骨質疏松癥將成為我國重要的公共健康問題，因此，開展骨質疏松癥研究具有較高的科學價值。目前，骨質疏松癥的發病機制尚不明確，在針對骨質疏松癥發生機制開展的各種研究方法中，動物模型是目前較為常用的一種研究方法。造模方法中的手術去勢是指通過去除雌性大鼠雙側卵巢的方法造成雌激素水平急劇下降、骨量大量丟失，建立骨質疏松癥模型，具有建模因素單一、建模成功率高、可重復性好、可信度高和能夠很好地體現雌激素水平下降這一重要病理生理現象等優點[3]。本實驗采用雌性大鼠作為研究動物[4]，通過陰道脫落細胞涂片、股骨密度測定、骨組織形態和原代骨髓間充質干細胞。
marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs)生長曲線4個層次的客觀指標來判定造模是否成功[5]。
1 材料
1.1 動物
SPF級SD雌性大鼠，許可證號：SCXK(湘)2016-0002，體質量190～250 g，6～8周齡，30只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，于湖南中醫藥大學清潔級動物實驗中心飼養，實驗單位許可證號：SYXK(湘)2013-005。動物分籠飼養。環境溫度為(22±4) ℃，濕度為50%±10%，自由進食進水，飼料為標準普通飼料(湖南中醫藥大學動物實驗中心提供)，并保持環境安靜，定時清掃鼠籠衛生。實驗過程中對動物的處置符合實驗動物管理和使用委員會的要求，適應性喂養1周后進行試驗。
1.2 試劑
低糖DMEM基礎培養(美國Gibco公司，批號8657263);FBS胎牛血清(美國Gibco公司，批號42A0071K);雙抗(美國Gibco公司，批號1999384);Trypsin-EDTA(美國Gibco公司，批號1868583);PBS(美國Hyclone公司，批號AD1779227);CCK-8試劑盒(上海七海復泰生物科技有限公司，批號20190124);FITC anti-mo/rat CD29抗體(美國eBioscience公司，批號11-0291-80);FITC anti-rat CD90抗體(美國Biolegend公司，批號206105);CD34(美國Abcam公司，批號ab81289);CL488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(美國Proteintech公司，批號SA00013-2)等。
1.3 儀器
HR30-IIA2型生物安全柜(中國海爾集團公司);311型CO2培養箱(美國賽默飛世爾科技公司);AE2000型倒置顯微鏡(中國麥克奧迪實業集團公司);低速離心機(美國萊伯特公司);DCW-3510型恒溫水浴鍋(中國寧波新芝生物科技股份有限公司);全身雙能X線骨密度儀(北京中西遠大科技有限公司);MIAS型醫學圖像分析系統(成都泰盟軟件有限公司);Ni-U型研究型正置顯微鏡(日本株式會社尼康公司);A00-1-1102型流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)等。
2 方法
2.1 動物分組及造模
按照隨機數字表法將30只SPF級雌性大鼠分為空白組、假手術組和模型組3 組，每組10只。模型組采用去除雌性大鼠雙側卵巢方法建立絕經后骨質疏松癥模型[5-6]，現配10%的水合氯醛溶液，濃度為3 mL/kg。假手術組和模型組大鼠腹腔注射水合氯醛溶液麻醉，俯臥位固定于大鼠板上，剃毛消毒后，沿第一胸腰椎兩側外1 cm處縱向切開皮膚肌肉，分離找到卵巢，結扎后完整摘除兩側卵巢，分兩層縫合切口，用無菌生理鹽水沖洗傷口，絡合碘消毒[7]。術后連續3 d在假手術組和造模組大鼠后腿肌肉內側注射青霉素，每只4萬IU/d，6 d后拆線，空白組不做任何處理。
2.2 雌性大鼠陰道脫落細胞涂片
造模后第1天清晨10點，取空白組、假手術組和模型組3組大鼠，用小號無菌棉簽進入大鼠陰道內，輕輕旋轉棉簽后，將陰道分泌物涂抹在已經滴加了少量生理鹽水的防脫玻片上(均勻平鋪即可)，待玻片自然風干后進行HE染色，1次/d，連續7 d。將7 d的玻片收集到一塊進行HE染色。
2.3 骨密度測定和骨組織HE染色觀察微細結構
造模后第8天，采用頸椎脫臼法處死所有動物。左側股骨組織用于骨密度測定和骨組織HE染色。每組5只雌性大鼠左后肢用濕紗布包裹，送至湖南中醫藥大學藥學院實驗中心送檢，用Unigamma X-RAY Plus雙能X線骨密度儀檢測雌鼠左后肢股骨密度。每組另5只雌性大鼠左后肢去除毛發后固定在4%PFA中，在5%的硝酸中脫鈣7 d，進行HE染色[8]，檢測股骨病理形態學變化。
2.4 BMMSCs的分離
造模后第8天，各組大鼠右側骨組織均用于提取BMMSCs。全骨髓貼壁法分離BMMSCs及傳代培養：清潔消毒操作區域，細胞房紫外消毒滅菌30 min，將大鼠右后肢在裝有醫用酒精的燒杯中浸泡2 min后剪去毛發及肌肉顯露骨組織，剪斷骨組織兩端骨骺露出骨髓腔，用預先配制好的DMEM完全培養液沖洗骨髓腔，將沖洗液收集在無菌15 mL BD管中，離心去上清，加完全培養基進行重懸后，轉移至25 cm2培養瓶中，做好組別和P0代標記。
2.5 BMMSCs的鑒定
細胞培養至P2代后對細胞進行鑒定。各取100 μL細胞懸液，分別加入到含抗體的離心管中，每種抗體分成5份，3種抗體總計15管，混勻，4 ℃避光孵育30 min，同時設置一管不染抗體管，具體標記如下(未染：不加抗體，不做染色;CD34：染CD34抗體;CD29：染CD29-FITC抗體;CD90：染CD90-FITC抗體)，PBS洗細胞2次，800 rpm離心5 min;其中CD34管繼續加入100 μL CL488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)二抗(1∶100稀釋)，繼續避光孵育1 h，PBS洗細胞2次，800 rpm離心5 min，350 μL PBS重懸細胞。上機檢測，進行細胞形態學觀察及表面標記抗原CD90、CD29和CD34的鑒定。
2.6 BMMSCs生長曲線測定
將P2代細胞胰酶消化，加入完全培養液終止消化后800 rpm離心5 min，去上清，重新加入完全培養液，對細胞懸液進行計數。經預實驗發現，BMMSCs在濃度為2×104個/mL時，CCK-8試劑盒檢測結果較為理想。該細胞生長周期為7 d，所以繪制完整的生長曲線需要7塊96孔板。按2×103個/孔，每孔100 μL接種到96孔板當中，依次加入空白組、假手術組、模型組細胞懸液，每組做5個復孔。第1天，在各孔中加入CCK-8溶液10 μL，4 h后在450 nm波長處進行OD值測定，依次7 d，繪制BMMSCs的生長曲線。
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