〔摘要〕 目的 探索扶正活血解毒方對檳榔堿提取物(areca nut extract， ANE)誘導的口腔黏膜下纖維化(oral submucous fibrosis， OSF)Wnt/β-catenin 信號通路的作用機制。方法 體外培養大鼠口腔黏膜上皮細胞(epithelial cell， EC)，分為正常組、模型組、中藥高/中/低劑量組和IWR-1組。以ANE為誘導劑，扶正活血解毒方含藥血清為干預藥物，以Wnt/β-catenin信號通路抑制劑IWR-1為陽性對照物，采用CCK8檢測EC細胞增殖;PCR檢測Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1基因的表達;Western blot檢測Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1蛋白的表達。結果 與正常組相比，模型組EC增殖水平提高，Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白表達增加，Axin基因及蛋白表達降低(P<0.05);與模型組相比，中藥高、中劑量組EC增殖水平降低，Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白表達降低，Axin基因及蛋白表達升高(P<0.05);與模型組相比，IWR-1組EC增殖水平降低，Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白表達降低，Axin基因及蛋白表達升高(P<0.05)。結論 扶正活血解毒方可通過調控Wnt/β-catenin信號通路，抑制ANE刺激的EC增殖，逆轉OSF癌前病變的形成。
〔關鍵詞〕 口腔黏膜下纖維化;檳榔堿提取物;扶正活血解毒;Wnt/β-catenin信號通路
口腔黏膜下纖維化或稱口腔黏膜下纖維性變(oral submucous fibrosis， OSF)是一種口腔黏膜潛在惡性疾病[1-2]。其癌變率高達7%，WHO將OSF列為癌前狀態[3]。流行病學調查表明，咀嚼檳榔是OSF主要的致病因素，但癌變機制尚不清楚，可能與檳榔的致癌成分檳榔堿、細胞因子、創傷及細胞免疫等關系密切[4-5]，尤其認為某些細胞因子參與了OSF的癌變過程，其中以Wnt與TGF-β1介導的信號通路最具代表性[6-8]。如何阻斷TGF-β與Wnt信號通路細胞因子間的聯系，將成為防治OSF癌變的關鍵。前期研究發現扶正活血解毒中藥通過調控TGF-β1/Smads信號轉導通路能具有抑制檳榔堿提取物(areca nut extract， ANE)刺激的EC細胞增殖的作用[9-11]。本研究將從Wnt/β-catenin信號轉導通路的角度探討扶正活血解毒方對OSF癌前病變的作用機制，為臨床OSF癌變的防治提供新的實驗依據。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗細胞 口腔黏膜上皮細胞(epithelial cell， EC)購自于中國上海賽百慷生物技術股份有限公司。收到細胞后，選擇相差顯微鏡對細胞進行鑒定，鏡下細胞為多角形，胞核大，培養皿中細胞鋪滿的位置顯微鏡下可見鋪路石狀。高倍鏡下未見成纖維細胞。
1.1.2 實驗藥物 (1)檳榔提取物(ANE)購于深圳潤慧生物科技有限公司。(2)扶正活血解毒方所用藥物為顆粒劑，由廣東三九制藥有限公司生產，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供。具體組方規格如下：丹參10 g，玄參10 g，當歸10 g，紅花5 g，生地黃10 g，白花蛇舌草10 g，夏枯草10 g，生黃芪10 g，薄荷10 g，白芍10 g，茵陳10 g，桔梗10 g。克數為生藥劑量，為同一批次同一產地藥材。將以上中藥按處方量取14劑，一劑生藥(共115 g)加入500 mL溫開水沖泡并充分攪拌，使用水煎濃縮的方法將藥物濃縮成500 mL液體，生藥濃度為0.23 g/mL，藥物現配現用。
1.1.3 含藥血清 8周齡SPF級雄性SD大鼠20只由湖南中醫藥大學動物實驗室提供，在SPF條件下適應性飼養1周。將大鼠隨機分為正常組、中藥高劑量組、中藥中劑量組和中藥低劑量組4組，每組5只，其中正常組以0.9%生理鹽水組灌胃8 mL/只，中藥高、中、低劑量組分別按照活扶正活血解毒方12、8、4 mL/kg灌胃[中藥低、中、高劑量大鼠灌胃量按照成人每日用量的1、2、3倍定為等效劑量(正常成人體質量按60 kg進行換算)]，每日2次，連續灌胃7 d。大鼠末次灌胃1 h后，行心臟取血，4 ℃、1 500 r/min離心10 min，取上清56 ℃滅活30 min，將滅活后的血清通過0.22 μm濾器過濾除菌，配置成完全培養基備用[12-13]。
1.1.4 主要試劑 大鼠口腔黏膜上皮細胞完全培養液(上海賽百慷生物技術股份有限公司，批號RATiCELLM013);胰酶(美國Hyclone，批號SH30042.01);2.24 μg/mL DispaseⅡ酶(美國Gibco，批號25200-027);PBS(美國Hyclone，批號SH30256.01B);CCK8增殖檢測試劑盒(日本DOJINDO，批號CK04);逆轉錄試劑盒(中國北京康為世紀，批號CW2569);Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(日本TOYOBO，批號QPK-201);引物由Genecopoeia合成;Wnt1抗體(英國Abcam，批號ab15251);β-catenin抗體(英國Abcam，，批號ab32572);Axin2抗體(英國Abcam，批號ab32197);cylinD1抗體(英國Abcam，批號ab251892);IWR-1(美國MCE，批號HY-12238);羊抗兔二抗(英國Abcam，批號ab6747);顯色液(美國Cyanagen，批號23423)。
1.1.5 主要儀器 全自動化學發光免疫分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司，型號UniCelDxI 800);Nanno Drop 分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司，型號NDoneC);基因擴增儀(美國MjRE-SEARCH公司，型號TTC-220);離心機(中國湖南湘儀，型號H1650R);Motic顯微鏡(成貫儀器上海有限公司，型號BA210T);酶標儀[美谷分子儀器(上海)有限公司，型號SpectraMax M4]。
1.2 方法
1.2.1 細胞分組及培養 分離培養的細胞增殖至對數期，將細胞分為正常組、模型組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組、IWR-1組6組。其中正常組以正常大鼠血清干預，模型組以正常大鼠血清+50 μg/mL ANE干預，中藥高、中、低劑量組分別以高、中、低劑量含藥血清+50 μg/mL ANE干預，IWR-1組以正常大鼠血清+5 μmol/L IWR-1。
1.2.2 CCK8檢測EC細胞增殖 將6組細胞按105/mL濃度接種于96孔板中，每孔100 μL，共鋪5板，檢測時間為12、24、36、48 h 4個時間點，在檢測前2 h加入CCK8 10 μL/孔，37 ℃ 5% CO2繼續培養至檢測時間點，取出培養板，放置于酶標儀中，450 nm和600 nm雙波長檢測并讀數[14-15]。
1.2.3 PCR檢測Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1基因的表達 將6組細胞按105/mL濃度接種于T25培養瓶中，培養至細胞長滿培養瓶，將其消化、離心、棄上清留存細胞。以RNA提取試劑盒提取細胞RNA，具體操作步驟根據試劑盒中的使用說明進行。RNA提取后，通過逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA，具體操作步驟根據逆轉錄試劑盒說明書進行。再根據反應體系將cDNA與SYBR溶液配比，進行PCR操作，并讀取mean CT值和△△CT值
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