摘 要：暗溫室是中華鱉(Pelodiscus sinensis)人工養(yǎng)殖的主要方式之一。為闡明中華鱉暗溫室養(yǎng)殖過程中高氮水體和低氮水體中微生物多樣性及其與環(huán)境因子的關(guān)系，在河北省鹿泉中華鱉暗溫室養(yǎng)殖池挑選了總氮濃度較高的池塘和總氮濃度較低的池塘進(jìn)行了水體理化因子監(jiān)測(cè)和微生物多樣性對(duì)比分析。水體理化因子檢測(cè)結(jié)果顯示兩種水體的溫度均在30 ℃左右，pH值為7左右，符合中華鱉的養(yǎng)殖要求。兩種水體的溶解氧為0.25 mg/L左右。高氮水體的總氮、氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮的濃度相較于低氮水體均比較高。高氮與低氮水體在各分類水平上的優(yōu)勢(shì)菌群均存在差異，低氮水體綠屈擾菌門(Chloroflexi)占據(jù)主要優(yōu)勢(shì)，而高氮水體中變形菌門(Proteobacteria)占主要優(yōu)勢(shì)，屬水平層次上低氮水體中的優(yōu)勢(shì)菌為束縛桿菌屬(Haliscomenobacter)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)。高氮水體多核桿菌屬(Polynucleobacter)、亮桿菌屬(Leucobacter)占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，兩種水體物種豐富度及相似度存在差異。結(jié)果表明高氮與低氮水體不僅在總氮和無機(jī)氮濃度上差別較大，微生物多樣性也存在明顯差距，微生物區(qū)系不同可能是造成氮濃度差異的原因之一。

　　關(guān)鍵詞：中華鱉(Pelodiscus sinensis);微生物多樣性;暗溫室養(yǎng)殖;理化因子;環(huán)境調(diào)控

　　中華鱉口感鮮美，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素以及微量元素，是一種高蛋白低脂肪的食物原料，長(zhǎng)期以來一直被視為珍品，市場(chǎng)需求高漲[1]。中華鱉現(xiàn)有養(yǎng)殖模式主要有日光棚集約化養(yǎng)殖、暗溫室高密度養(yǎng)殖、日光棚+暗溫室兩段式養(yǎng)殖、仿生態(tài)養(yǎng)殖等[2]。高密度的暗溫室養(yǎng)殖養(yǎng)殖密度大、產(chǎn)量高，優(yōu)點(diǎn)是光線較弱，中華鱉互相撕咬現(xiàn)象明顯減少，缺點(diǎn)是水體中殘餌和糞便積累，養(yǎng)殖水體污染嚴(yán)重，患病幾率增加。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)河北省鹿泉中華鱉暗溫室高氮和低氮養(yǎng)殖水體進(jìn)行水質(zhì)理化參數(shù)監(jiān)測(cè)和微生物多樣性分析，闡明水體環(huán)境參數(shù)和微生物區(qū)系組成，為改善養(yǎng)殖水體水質(zhì)特別是減少氮源污染，實(shí)現(xiàn)中華鱉健康養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

　　1 材料和方法

　　1.1 樣品采集

　　分別取中華鱉良種場(chǎng)暗溫室兩個(gè)池塘養(yǎng)殖水體樣品，總氮濃度較高的養(yǎng)殖池塘，記為H-N，總氮濃度較低的養(yǎng)殖池塘，記為L(zhǎng)-N。分別在兩個(gè)池塘的左、中、右位置取水，每個(gè)池塘取3個(gè)水樣，用于水質(zhì)監(jiān)測(cè)和微生物多樣性分析。

　　1.2 水體理化因子分析

　　現(xiàn)場(chǎng)采樣過程中，采用YSI pH100A便攜式酸度計(jì)測(cè)定pH值，采用YSI DO200便攜式溶氧儀測(cè)定溶解氧濃度。水樣帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定總氮、氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮等化學(xué)指標(biāo)。總氮采用堿性過硫酸鉀消解-紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定，氨氮采用納氏試劑-分光光度法進(jìn)行測(cè)定，亞硝酸鹽采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法進(jìn)行測(cè)定，硝酸鹽采用紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定[3]。

　　1.3 水體微生物多樣性分析

　　1.3.1 樣品處理 過濾前靜置分離懸浮顆粒，用20 μm大孔徑濾膜預(yù)過濾一遍，再用0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行抽濾，水樣過濾之后，將微生物富集的濾膜裝在50 mL離心管中，在-80 ℃冰箱中保存。

　　1.3.2 DNA提取、PCR和高通量測(cè)序 水體微生物多樣性由上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)定。提取總DNA，采用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行濃度和質(zhì)量檢測(cè)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物：520F：5’-barcode+AYTGGGYDTAAAGNG-3’， 802R： 5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V4區(qū) (C，T = Y; G，A，T = D; A，C，G = V; A，C，G，T =N) 。PCR產(chǎn)物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行磁珠純化回收。回收產(chǎn)物采用酶標(biāo)儀Microplate reader(BioTek，F(xiàn)Lx800)測(cè)定濃度，所用試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit。根據(jù)測(cè)定的濃度，按照每個(gè)樣本的測(cè)序量需求，對(duì)各樣本按相應(yīng)比例進(jìn)行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫，最后上機(jī)進(jìn)行高通量測(cè)序。

　　1.3.3 測(cè)序數(shù)據(jù)的篩查與處理 運(yùn)用QIIME 2軟件切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列。隨后，通過QIIME 2軟件調(diào)用DADA2進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體序列獲取高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。

　　1.3.4 物種分類學(xué)注釋 對(duì)于細(xì)菌或古菌的16S rRNA基因，默認(rèn)選用Greengenes數(shù)據(jù)庫。對(duì)于每個(gè)ASVs的特征序列或每個(gè)OTU的代表序列，在QIIME2軟件中使用默認(rèn)參數(shù)，使用預(yù)先訓(xùn)練好的Naive Bayes分類器進(jìn)物種注釋。

　　1.3.5 α-多樣性分析 多樣性是指局部均勻生境下的物種在豐富度(richness)、多樣性(diversity)和均勻度(evenness)等方面的指標(biāo)[4]，也被稱為生境內(nèi)多樣性，反映的是單個(gè)樣品中的物種多樣性。采用香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener diversity index)、辛普森多樣性指數(shù)(Simpson diversity index)、Chao1指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)(Pielou evenness index)和覆蓋率(Coverage)對(duì)6個(gè)樣品中微生物的α-多樣性進(jìn)行比較和分析[5]。樣品中的群落多樣性用香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)[6]和辛普森指數(shù)估算，樣品中的物種總數(shù)(OTU數(shù)目的指數(shù))用Chao1[7]算法估計(jì)，樣品中群落的均勻度用Pielou均勻度指數(shù)估算，用樣品文庫的覆蓋率[8]評(píng)價(jià)測(cè)序結(jié)果的真實(shí)性。

　　1.3.5 物種差異分析及標(biāo)志物種 為了探究微生物群落組成上的差異(即β-多樣性)，了解微生物群的差異主要是由哪些物種的差異分布所導(dǎo)致的，借助ASV/OTU維恩圖、物種組成熱圖、LEfSe分析等方法來進(jìn)行分析，進(jìn)一步展示樣品間的物種差異。

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