摘要：構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-N，經(jīng)原核表達(dá)純化獲得小反芻獸疫病毒N蛋白。將純化的小反芻獸疫病毒N蛋白與對應(yīng)的酶標(biāo)二抗配對，通過對各個反應(yīng)條件的優(yōu)化建立了間接化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法。通過對血清樣本的檢測，對該方法的敏感性、特異性、重復(fù)性、符合率進(jìn)行了評價。試驗結(jié)果顯示：N蛋白最適包被濃度為0.5 μg/mL，最適包被條件為4℃ 24 h;酶標(biāo)二抗最適工作濃度為1∶2000。特異性試驗證明，該方法與羊常見病毒的抗體陽性血清沒有交叉反應(yīng)。通過檢測大量小反芻獸疫病毒抗體陰、陽型血清，確定了科學(xué)的判定標(biāo)準(zhǔn)。

　　關(guān)鍵詞：原核表達(dá);最適條件;臨界值

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　　小反芻獸疫(Peste des Petits Ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV)引起的一種反芻動物的烈性病毒性疾病。小反芻獸疫病毒具有高度傳染性，綿羊和山羊為主要感染動物，偶爾感染野生小反芻動物，例如巖羊、野山羊等[1]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。在《2018年國家動物疫病強制免疫計劃》規(guī)定對全國所有羊進(jìn)行小反芻獸疫免疫。本試驗利用原核表達(dá)的小反芻獸疫N蛋白作為包被抗原與其酶標(biāo)二抗配對，構(gòu)建了間接化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 主要試劑

　　pET-28a原核表達(dá)載體、BL21感受態(tài)細(xì)胞由本公司實驗室保存;法國ID-VET《小反芻獸疫抗體檢測試劑盒》購于上海拜力生物科技有限公司;小反芻獸疫活疫苗(Clone9株)購于新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司。

　　1.1.2 血清樣本

　　小反芻獸疫陽性血清、小反芻獸疫陰性血清購于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。500份已知來源的臨床羊血清由洛陽萊普生信息科技有限公司提供，并經(jīng)法國ID-VET小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒檢驗證明。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小反芻獸疫N蛋白的表達(dá)

　　小反芻獸疫病毒是單股負(fù)鏈RNA病毒，編碼8種已知蛋白，其中6種為結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、大蛋白(L)、血凝素蛋白(H)和融合蛋白(F)。大多數(shù)血清學(xué)檢測技術(shù)是針對小反芻獸疫病毒的核衣殼蛋白和血凝素蛋白而建立的[2]。大多數(shù)的單鏈RNA病毒，包括小反芻獸疫病毒在內(nèi)，N蛋白高度保守，免疫原性也較高。由于接近病毒基因組的3'末端，N蛋白的含量比其他結(jié)構(gòu)蛋白都要高。雖然針對N蛋白的抗體不能保護(hù)動物免受該病侵害，但由于抗原性較好而且含量豐富，N蛋白仍然是小反芻獸疫診斷工具最易接受的目標(biāo)[3]。

　　從gene bank上查找小反芻獸疫N蛋白的基因序列號為AJ563705.1，并設(shè)計引物。上游引物序列為：5'-AATAGGATCCGCG CACGTGAACGACATGCTGA -3'，下游引物序列為：5'-CGGAAGCTTAATGTCGTAGAACTTGAGCGTGTG-3'。使用RNA提取試劑盒從小反芻獸疫疫苗中提取病毒核酸。并通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA，使用上述一對引物擴增出小反芻獸疫N蛋白主要抗原表位區(qū)基因。將擴增出來的目的基因、pET-28a空載體分別經(jīng)雙酶切之后與pET-28a載體連接。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)過條件篩選，確定合適的IPTG誘導(dǎo)濃度，培養(yǎng)溫度。經(jīng)表達(dá)純化獲得的小反芻獸疫N蛋白可作為試劑盒生產(chǎn)中的包被抗原使用。

　　1.2.2 包被緩沖液的選擇

　　分別選取25mM PBS(pH值7.4)、碳酸鹽緩沖液(pH值9.6)、50mM Tris-HCl(pH值8.0)作為包被緩沖液，包被濃度均為1 μg/mL。每孔100 μL，2～8℃放置24 h。用PBST洗板2次，每孔加入1.5% BSA，2～8℃封閉24 h。陽性對照血清1/20稀釋之后加入到化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板中，每孔加入100 μL，最后一行作為無血清對照。37℃反應(yīng)1 h，PBST洗滌5次，吸水紙上拍干之后，每孔加入100 μL工作濃度的羊抗豬酶標(biāo)二抗。37℃反應(yīng)1 h，PBST洗滌5次，吸水紙上拍干之后，每孔加入化學(xué)發(fā)光底物A液50 μL、化學(xué)發(fā)光底物B液50 μL。室溫、避光反應(yīng)5 min，使用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀讀數(shù)。

　　1.2.3 包被條件的摸索

　　分別選取37℃ 3 h、4℃ 16 h、4℃ 24 h、三種包被條件進(jìn)行摸索。以1 μg/mL的蛋白濃度進(jìn)行包被，每孔加入100 μL。使用1.5% BSA封閉，陽性對照血清1/20稀釋之后加入化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板進(jìn)行反應(yīng)。選擇化學(xué)發(fā)光值高，并且變異系數(shù)最小的條件進(jìn)行包被。

　　1.2.4 封閉緩沖液的選擇

　　分別選取 1.5% BSA、1%酪蛋白、10%馬血清、3%明膠作為封閉液。封閉條件為2～8℃24 h。在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板上測定陽性對照血清、陰性對照血清，計算二者化學(xué)發(fā)光值的比值(P/N)，根據(jù)比值大小確定最適封閉液。

　　1.2.5 血清稀釋倍數(shù)和抗原包被濃度的確定

　　使用棋盤滴定法來篩選最佳條件。使用包被緩沖液在化學(xué)發(fā)光包被板上按照濃度梯度進(jìn)行包被。選取陽性對照血清、陰性對照血清進(jìn)行梯度稀釋，進(jìn)行測定。實驗布局如表1所示。根據(jù)最終讀取的化學(xué)發(fā)光值計算陽性對照血清、陰性對照血清二者的比值(P/N)，比值最大時為最適抗原包被濃度與血清稀釋倍數(shù)。