摘要： 鹽芥是研究耐鹽機(jī)理的模式植物。為從蛋白質(zhì)水平揭示鹽芥響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制，本研究采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ) 技術(shù)對(duì)不同NaCl濃度處理7 d的鹽芥葉片進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果表明，鹽芥葉片中共鑒定到4 607個(gè)蛋白質(zhì)，其中281個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度顯著增加，95個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度顯著降低。鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG代謝通路和蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，促進(jìn)植株光合作用可幫助鹽芥適應(yīng)低鹽環(huán)境;抑制葉綠素和支鏈氨基酸合成、調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá)是鹽芥應(yīng)對(duì)中鹽環(huán)境的重要因素;而有效清除活性氧、提高滲透物質(zhì)積累量和增加能量供應(yīng)可能是鹽芥耐受高鹽環(huán)境的關(guān)鍵。本研究結(jié)果為揭示鹽芥應(yīng)答鹽脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

　　關(guān)鍵詞： 鹽芥;鹽脅迫;差異蛋白質(zhì);iTRAQ

　　鹽脅迫是自然界中主要的非生物脅迫之一，土壤中的高濃度鹽分會(huì)使植物體內(nèi)離子失衡，產(chǎn)生滲透壓力，從而嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[1]。鹽芥是一年生草本植物，屬真鹽生植物，多生長(zhǎng)于鹽漬化土壤中。鹽芥是擬南芥的近親[2-3]，同樣具有生長(zhǎng)周期短、基因組構(gòu)成小(約為擬南芥的2倍)、種子數(shù)目多、可利用農(nóng)桿菌侵染花序法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、遺傳轉(zhuǎn)化效率高等特點(diǎn)。因此，近幾年鹽芥被提出作為耐鹽分子機(jī)理研究的理想模式植物[2，4-5]。雖然鹽芥和擬南芥有很多相似的特性，但兩者之間的耐鹽性卻存在很大差異。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析擬南芥和鹽芥在響應(yīng)鹽脅迫的差異時(shí)，發(fā)現(xiàn)擬南芥中存在的鹽脅迫響應(yīng)基因，不管是否處于鹽脅迫環(huán)境，在鹽芥中均能高豐度表達(dá)[6-7]，說(shuō)明鹽芥在面對(duì)逆境時(shí)是“有備無(wú)患”;而且鹽芥中存在特有的新陳代謝途徑，使得其在鹽脅迫條件下能減少由植物激素所誘導(dǎo)的生理修飾[8]，從而能在一定程度上承受更大的脅迫壓力。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫條件下，鹽芥根系的磷酸化蛋白質(zhì)組發(fā)生改變，這些變化的磷酸化蛋白質(zhì)參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、活性氧清除、能量途徑、蛋白質(zhì)合成以及蛋白質(zhì)折疊等過(guò)程[9]，這些研究為將來(lái)從磷酸化水平上研究鹽芥的耐鹽機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。

　　目前，人們已從鹽芥中鑒定到一些與鹽脅迫耐受相關(guān)的基因和調(diào)控因子，如編碼K+/Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(ThHKT1)[10-11]、編碼細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(ThNHX1)和(ThSOS1)[12-14]、焦磷酸酶基因(TsVP) [15-17]、高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)體(ThHAK5)[18]、脯氨酸合成基因(ThP5CS)[19]、Cu/Zn超氧化物歧化酶基因(ThCSD)[20]等，且部分基因的生物學(xué)功能已得到一定的闡述。我們前期對(duì)鹽芥葉片和葉綠體響應(yīng)鹽脅迫的比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果表明，鹽芥可通過(guò)Na+液泡區(qū)隔化，積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(如淀粉、可溶性糖、脯氨酸等)，以及維持光合效率和生長(zhǎng)發(fā)育等方式來(lái)適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境[21-22]。本研究在已有的研究基礎(chǔ)上，應(yīng)用先進(jìn)的同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ)對(duì)不同鹽濃度處理?xiàng)l件下的鹽芥葉片進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，并重點(diǎn)分析不同鹽濃度處理對(duì)鹽芥葉片蛋白質(zhì)表達(dá)豐度的影響，期望揭示鹽芥適應(yīng)不同鹽濃度條件的蛋白質(zhì)化學(xué)機(jī)制，為揭示鹽芥耐鹽分子機(jī)制提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

　　將鹽芥種子直接點(diǎn)播在基質(zhì)土(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1，體積比)中，放置在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度為白天22 ℃，晚上20 ℃;相對(duì)濕度為60%±5%;16 h光照，8 h黑暗。種子發(fā)芽后，用1/2濃度Hoagland營(yíng)養(yǎng)液每3 d澆灌1次。2個(gè)月后，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的鹽芥植株用含有0 mmol/L、200 mmol/L(低鹽)、400 mmol/L(中鹽)和600 mmol/L(高鹽)NaCl的1/2濃度Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行澆灌，每天更換新的營(yíng)養(yǎng)液，每個(gè)鹽濃度處理36株植株。收集連續(xù)澆灌7 d(根據(jù)前期的預(yù)試驗(yàn)確定的鹽處理時(shí)間)的鹽芥葉片，每12株為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2 鹽芥葉片蛋白質(zhì)的提取、酶解及iTRAQ分析

　　參照Wang等[23]的BPP法提取鹽芥葉片總蛋白質(zhì)，用預(yù)冷的甲醇和丙酮清洗蛋白質(zhì)沉淀，然后溶解在蛋白質(zhì)裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS(一種非變性的兩性離子型去垢劑)，30 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5)中。以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過(guò)Bradford測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度[24]。取100 μg用不同濃度的NaCl處理的鹽芥葉片總蛋白質(zhì)，用胰蛋白酶進(jìn)行消化后，使用iTRAQ試劑分別標(biāo)記0 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L和 600 mmol/L NaCl處理的上述葉片總蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物后，再進(jìn)行等量混合。采用強(qiáng)陽(yáng)離子變換(SCX)色譜柱(4.6 mm×250.0 mm， Aqua C18， 5 μm， 100 )對(duì)iTRAQ標(biāo)記的肽段進(jìn)行預(yù)分級(jí)，再通過(guò)液相串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)標(biāo)記肽進(jìn)行鑒定，獲取差異表達(dá)肽段信息。

　　1.3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜庫(kù)

　　使用Proteinpilot軟件(Version 4.5)對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行搜庫(kù)，搜索數(shù)據(jù)庫(kù)為自建的鹽芥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，蛋白數(shù)據(jù)從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/12266)上下載。搜庫(kù)參數(shù)設(shè)置為：酶類(lèi)為T(mén)rypsin，錯(cuò)誤剪切位點(diǎn)數(shù)為1，固定修飾位點(diǎn)為Carbamidomethyl(C)，可變修飾位點(diǎn)為Oxidation(M)。將0 mmol/L NaCl處理鹽芥葉片蛋白質(zhì)作為對(duì)照組，200 mmol/L NaCl、400 mmol/L NaCl、600 mmol/L NaCl作為處理組，按處理組與對(duì)照組離子的峰面積比值，選擇置信度在95%以上的結(jié)果進(jìn)行報(bào)告。質(zhì)譜鑒定出的可信蛋白質(zhì)篩選參數(shù)應(yīng)滿(mǎn)足：可信度在95%以上的肽置信水平，至少鑒定出2條肽段，且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤1%。

　　1.4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析

　　通過(guò)KEGG途徑分析對(duì)可信鑒定的蛋白質(zhì)參與的代謝通路進(jìn)行富集。同時(shí)，對(duì)鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)(變化倍數(shù)>1.50或<0.67，P<0.05)進(jìn)行KEGG代謝途徑和蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)分析(https：//string-db.org/cgi/input.pl)。

　　1.5 部分鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)基因的qRT-PCR分析

　　提取用不同鹽濃度處理的鹽芥葉片總RNA，取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA樣品稀釋5倍后用于qRT-PCR分析，每個(gè)樣品至少重復(fù)3次qRT-PCR試驗(yàn)。取1 μl稀釋后的cDNA加入到SYBR Green PCR Master mix體系中，使用Mx3005P熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，鹽芥的actin基因(NCBI基因登錄號(hào)312283264)作為內(nèi)參基因。用于qRT-PCR的引物序列詳見(jiàn)表1。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 鹽芥葉片蛋白質(zhì)種類(lèi)分析及鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)的篩選

　　應(yīng)用iTRAQ技術(shù)結(jié)合AB5600+高端生物質(zhì)譜儀對(duì)鹽芥葉片總蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，3次iTRAQ重復(fù)鑒定出的可信蛋白質(zhì)數(shù)分別為3 750個(gè)、3 897個(gè)和3 901個(gè)，共計(jì)4 607個(gè)蛋白質(zhì)至少在1次重復(fù)中鑒定到的可信的鹽芥葉片總蛋白質(zhì)，其中3 811個(gè)蛋白質(zhì)至少在2次重復(fù)試驗(yàn)中得到可信鑒定(圖1A)。這3 811個(gè)可信蛋白質(zhì)參與了18條代謝途徑，其中碳水化合物代謝途徑參與的蛋白質(zhì)種類(lèi)最多(988個(gè)蛋白質(zhì))，其次是翻譯類(lèi)蛋白質(zhì)(895個(gè)蛋白質(zhì))與折疊、分類(lèi)和降解類(lèi)蛋白質(zhì)(830個(gè)蛋白質(zhì))、氨基酸代謝(579個(gè)蛋白質(zhì))、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(547個(gè)蛋白質(zhì))、運(yùn)輸和分解代謝(522個(gè)蛋白質(zhì))、脂質(zhì)代謝(496個(gè)蛋白質(zhì))、環(huán)境適應(yīng)(452種蛋白質(zhì))、能量代謝(416種蛋白質(zhì))等代謝途徑類(lèi)蛋白質(zhì)(圖1B)。

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