摘 要：利用鼠胚傳代培養(yǎng)細胞，制備細胞爬片，并分別運用考馬斯亮藍R250和FITC-鬼筆環(huán)肽來染色顯示細胞微絲，探索和改進實驗方法，以便有效觀察細胞微絲的分布和形態(tài)結構。結果顯示，采用鼠胚傳代培養(yǎng)細胞作為實驗材料，傳代成纖維狀細胞鋪展良好，經固定、通透并染色后，可在普通光學顯微鏡和熒光顯微鏡下顯示微絲束在細胞中的分布，既便于實驗觀察，也有助于學生對微絲骨架作用的理解和掌握。

　　關鍵詞：微絲;細胞骨架;熒光顯微鏡

　　在細胞內，微絲是由肌動蛋白分子螺旋狀聚合形成的纖維絲，而肌動蛋白又以肌動蛋白單體(或稱球狀肌動蛋白，G-actin)或由單體組裝而成的纖維狀肌動蛋白(F-actin)多聚體2種形式存在。F-actin是由多個G-actin構成的長鏈纖維，2條F-actin反相平行結合成螺旋鏈，發(fā)揮生理功能。由微絲形成的微絲束又稱為應力纖維，常橫貫于細胞長軸。微絲對細胞貼附、鋪展、運動、內吞、細胞分裂等許多細胞功能起著重要作用，而微絲又與微管、中間絲組成真核細胞中的三維纖維網絡骨架體系，這些由蛋白質聚合而成的細胞骨架主要功能包括：調節(jié)細胞內容物的空間分布，介導細胞內外的信號轉導，調節(jié)細胞運動及形態(tài)。研究表明，細胞骨架的結構受到多種細胞因子的調節(jié)，細胞骨架的改變也與一些疾病的發(fā)生密切相關[1]，如囊性纖維化肺這一慢性疾病除了受到相關基因調控外，還提示與誘導增加肌動蛋白的聚合，從而促進微絲束的形成相關[2]。

　　“動物細胞微絲的觀察”是生物科學本科層次開設的實驗必修項目之一，現(xiàn)有的教學實驗參考指導書[3-5]，大多所列實驗步驟較復雜，實驗所用細胞及試劑材料無法購買，或在本科實驗教學中顯示效果不明顯。近年來，筆者在細胞生物學實驗教學中，利用鼠胚組織進行原代培養(yǎng)并成功傳代培養(yǎng)形成的成纖維狀細胞作為實驗材料，開展了動物細胞骨架的標記及觀察實驗。實驗分別采用非特異性蛋白質染料考馬斯亮藍，以及特異性熒光染料FITC-鬼筆環(huán)肽來標記染色，通過光學顯微鏡與熒光顯微鏡來觀察微絲在細胞中的分布及形態(tài)特征。與考馬斯亮藍R250這一普通蛋白質染料不同，鬼筆環(huán)肽是從毒性菇類中分離的生物堿，它同細胞松弛素的作用相反，不與肌動蛋白單體分子結合，只與多聚體的F-actin結合，而用FITC或Rhodamin等熒光物質標記的鬼筆環(huán)肽可特異性的顯示微絲骨架在細胞中的分布。

　　1 實驗材料

　　實驗細胞：小鼠鼠胚傳代培養(yǎng)細胞(來源于本科學生培養(yǎng)的鼠胚組織原代培養(yǎng)細胞)。

　　實驗試劑及器材：1640培養(yǎng)基、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液、4%多聚甲醛、0.1%TritonX-100、0.25%考馬斯亮藍R250、5μg/mL的FITC-鬼筆環(huán)肽、5μg/mL Hochest33258、24孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板用圓形細胞爬片(即圓形蓋片，直徑14mm)、parafilm封口膜。

　　2 實驗方法

　　2.1 細胞爬片的制備 將生長良好的鼠胚傳代培養(yǎng)細胞消化后，稀釋細胞至104～105個/mL濃度。準備24孔培養(yǎng)板，每孔預先放入適量血清培養(yǎng)基，并放入無菌圓形爬片，細胞添加至圓形爬片上方。如不用24孔培養(yǎng)板，爬片也可放入無菌培養(yǎng)皿內進行細胞培養(yǎng)。37℃，5%CO2條件下繼續(xù)進行細胞培養(yǎng)。

　　2.2 細胞的固定及通透 24h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，標記生長良好的培養(yǎng)孔，吸去培養(yǎng)基，用37℃預溫PBS輕輕清洗細胞3次，快速洗去殘留的培養(yǎng)基及血清。加入4%的多聚甲醛固定20min，吸去固定液，再用PBS清洗細胞3次。加入0.1%TritonX-100處理20～30min，繼續(xù)用PBS清洗細胞3次。小心取出在24孔培養(yǎng)板內培養(yǎng)有鼠胚傳代培養(yǎng)細胞的蓋片，略晾干后，進行后續(xù)的染色實驗。

　　2.3 制片及染色方法 首先，在2片封口膜上分別滴加0.25%考馬斯亮藍R2505μL和5μg/mL的FITC-鬼筆環(huán)肽5μL。取出處理過的細胞爬片倒扣在膜上室溫避光染色40min(即細胞面朝下反扣在預加染色液的膜上)，夏季時間可以短一些。染色完成后用PBS輕緩沖洗清洗細胞3次，洗去多余的染液。考馬斯亮藍染色的細胞爬片，可待爬片稍晾干后，直接放于載玻片上用普通光學顯微鏡在白光下觀察。而用FITC-鬼筆環(huán)肽染色的細胞爬片，繼續(xù)倒扣在5μg/mLHochest33258染液中染色細胞5～10min，用PBS清洗細胞3次后，細胞爬片也同樣放在載玻片上，用熒光顯微鏡觀察。

　　2.4 普通光學顯微及熒光顯微鏡的觀察 染色細胞爬片均運用Olympus BX41顯微鏡觀察，40倍物鏡下已能清晰觀察到鋪展良好的成纖維狀鼠胚傳代培養(yǎng)細胞，用DP70攝像頭進行顯微拍攝，并用Image Pro Plus 5.0(IPP)軟件對所有顯微照片進行標尺標記，雙熒光圖片則使用IPP軟件進行熒光照片的拼合。

　　3 結果與分析

　　3.1 考馬斯亮藍R250染色效果 運用普通光學顯微鏡在白光下觀察，鼠胚傳代成纖維狀細胞的生長分裂旺盛，細胞鋪展好，形態(tài)舒展并有較多的細胞附著在蓋玻片上，可清晰觀察到考馬斯亮藍染色的鼠胚細胞胞體突出豐富，立體感強，不僅可見染成淺藍色縱貫細胞軸的微絲，還可見染成深藍色的細胞核。

　　3.2 雙熒光染料染色效果 用FITC-鬼筆環(huán)肽與Hochest33258雙熒光染色的細胞，用紫外光激發(fā)，則細胞核產生明亮的藍色熒光，而用藍光激發(fā)，微絲則產生清晰的綠色熒光。用IPP軟件拼合標記細胞核及微絲。

　　4 結論

　　在“動物細胞微絲的觀察”教學實驗中，我們運用考馬斯亮藍R250和FITC-鬼筆環(huán)肽對微絲進行對照標記顯示。考馬斯亮藍并不能夠特異性地顯示細胞微絲的分布，是利用Triton X-100處理細胞后可以脫除不穩(wěn)定的非骨架蛋白，而結構穩(wěn)定的微絲蛋白仍能保留下來染色顯示。而用FITC熒光物質標記的鬼筆環(huán)肽可特異性的顯示微絲骨架在細胞中的分布，在本實驗中顯示效果好，熒光清晰，染色對比明顯，有助于學生對細胞微絲理解和掌握。

　　細胞生物學實驗是一門單獨設課的實驗課程，實驗課只在每周固定時間段開設，學生無法連續(xù)進行實驗。近年來，通過多次試驗、反復摸索和研究，形成了從鼠胚原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、細胞活性觀察、細胞骨架染色顯示及運用CCK8法檢測細胞增殖這一系列可每周單獨設課的連續(xù)實驗內容。其中“動物細胞微絲的觀察”這一實驗項目，根據(jù)實驗設計，實驗從已制備好的細胞爬片開始，到最后完成細胞微絲的顯微觀察大約需要4個學時。微絲顯示效果好，學生參與度高，取得了很好的教學效果。

　　參考文獻

　　[1]陳業(yè)成，趙洪文.細胞骨架與腫瘤之間的關系研究進展[J].國際呼吸雜志，2018(12)：933-936.

　　[2]Corvol H，Rousselet N，Thompson K E，et al.FAM13A is a modifier gene of cystic fibrosis lung phenotype regulating rhoa activity，actin cytoskeleton dynamics and epithelial-mesenchymal transition[J].Journal of Cystic Fibrosis，2018，17(2)：190-203.

　　[3]李素文.細胞生物學實驗指導[M].北京：高等教育出版社，2001.

　　[4]丁明孝，蘇都莫日根，王喜忠，等.細胞生物學實驗教程[M].北京：高等教育出版社，2013.

　　[5]桑建利，譚信.細胞生物學實驗指導[M].北京：科學出版社，2010.

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