摘 要：多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)屬于芽孢桿菌屬，是一類產芽孢的革蘭氏陽性細菌，可以產生多肽類、蛋白類、酶類、功能性多糖及其他代謝活性物質。現代研究表明，多糖類化合物具有廣泛的生理功能。隨著研究的不斷深入，多粘類芽孢桿菌胞外多糖已被證明具有抗氧化性、免疫活性、抗腫瘤性等功能，在生物醫藥領域及生態農業方面有著廣泛的發展前景。該文綜述了多粘類芽孢桿菌菌株來源及其胞外多糖的發酵工藝、提取、分離純化、結構分析及功能方面的研究進展，并對其未來的發展研究進行了展望。
關鍵詞：多粘類芽孢桿菌;胞外多糖;發酵工藝;提取;結構分析;生物活性
多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)是類芽孢桿菌的模式菌[1]。類芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性好氧或兼性厭氧菌，能產生芽孢，抗逆性極強，在高酸、高堿、高寒、高鹽的逆境下生長良好[2]。其細胞呈直桿狀，菌落特征多成淺黃色或白色的黏稠狀，表面濕潤光滑;靠周生的鞭毛運動，膨大孢子囊中產生橢圓形芽孢;最適生長溫度為28～35℃，最適pH7.0，能產酸，有時產氣[3]。多粘類芽孢桿菌廣泛存在于自然界中，多數在植物體內外及根際土壤中分離而來，作為一類重要的根際有益菌[4]，其具有促進植物生長和生物防治的作用，被廣泛應用于農業領域。多粘類芽孢桿菌具有良好的生物學活性物質，如蛋白質類、多糖、多肽類、脂類[5]。近年來的研究表明，多粘類芽孢桿菌胞外多糖具有凈化水質[6]，吸收廢水中的重金屬離子[7]等作用，在環境生態領域中具有重要的應用價值。此外，它還具有抗氧化性、抗腫瘤性、調節免疫等生物活性，在醫藥領域中有著重要作用。多粘類芽孢桿菌產胞外多糖在農藥助劑方面也發揮著重要作用，包括助懸浮和熱保護作用[8]。多粘類芽孢桿菌有多種生物學活性，對人畜安全和無污染，具有廣泛的應用前景而受到青睞，美國環保署(EPA)將其列為可在商業上應用的微生物[9]。
胞外多糖作為一種生物材料的來源，近年來受到了越來越多的關注。微生物多糖具有生產過程可控性高、不受外界因素影響、生產周期短，具有獨特的理化性質及生物活性等優勢，已被廣泛應用于各個領域。微生物多糖由范圍極廣的單糖構成，具有十分復雜的結構，其活性受發酵條件、提取工藝、純度、含量等多因素的綜合影響。因此，菌株發酵的條件及胞外多糖的提取、分離純化對后續結構分析鑒定及其活性功能的研究尤為重要。在多粘類芽孢桿菌發酵過程中，會產生大量的胞外多糖，容易分離提取。本文綜述了多粘類芽孢桿菌的來源及其多糖的提取工藝、純化、結構分析及其功能進展，并對未來相關領域研究進行了展望，為多粘類芽孢桿菌胞外多糖的綜合應用以及進一步研究提供參考。
1 菌株來源
多粘類芽孢桿菌在自然界中分布廣，廣泛分布于土壤、植物的體表以及根部，也是常見的植物內生菌。目前，多粘類芽孢桿菌多從植物的根際土壤中分離而來。劉訓理[10]等從泰山土壤中分離得到1株對多種動植物病原細菌和真菌具有較強拮抗作用的多粘芽孢桿菌Cp-s316。陳雪麗[11]等從大豆根際土壤中分離得到多粘芽孢桿菌BRF-1。張道敬[12]等在番茄的根際土壤中分離得1株生防菌株多粘芽孢桿菌HY96-2。林茂茲[13]等從太子參根際土壤中篩選出對尖孢鐮刀菌有很強抑制作用的多粘類芽孢桿菌S960。張宏福[14]等從中華蘆薈中分離到1株植物內生菌多粘類芽孢桿菌A11，并且對該菌進行了全基因組測序。吳棣[15]等自中國貴州辣椒根際土壤中分離得一株具有良好的拮抗性能并具有較好的植物促生及溶磷、解鉀的能力的多粘類芽孢桿菌SC2。鄂垚瑤[16]等從西瓜種植發病區健康植株根際分離得到的一株兼具促生及生防功能的根際有益菌多粘類芽孢桿菌SQR-21。李玉洋[17]等從水稻根際土壤中篩選得到1株對水稻惡苗病菌拮抗作用較強的多粘類芽孢桿SH15。王波[18]等從大豆植株中分離得到多粘類芽孢桿菌XZ-2。
2 發酵工藝
在發酵產胞外多糖的過程中，發酵培養基成分和發酵條件對胞外多糖的合成至關重要，通過優化培養基成分和發酵條件促進菌體生長及其生理代謝，是提高胞外多糖產量的重要手段，成為優化多糖生產工藝的研究熱點。優化發酵工藝通常使用單因素試驗、正交試驗、響應面設計方法相結合，綜合探究不同因素之間的交互作用。
2.1 培養基優化 培養基組分在很大程度上影響著微生物生長及其代謝產物的積累，適合菌體生長繁殖的培養基不一定適合于代謝產物的積累。不同的菌株對碳源、氮源、生長因子和無機鹽離子等營養物質種類和濃度的要求大有不同，不同代謝物的產生對這些要求也不同。因此，為提高多糖產率，需對培養基成分進行優化。碳源不僅是微生物菌體的能源物質，也是合成菌體和目的產物的碳成分提供者。碳源對菌體產多糖的數量和質量起著關鍵作用。不同的碳源對微生物的生長及其多糖的合成有一定的影響。氮源是細胞物質(氨基酸、蛋白質、核酸等)和含氮代謝物的組分，是菌體生長繁殖的必需營養素，為微生物生長提供營養所需的氮元素，也是合成多糖的重要成分，適宜的氮源及添加量有利于多糖的合成。無機鹽及微量元素是微生物生理活性物質的組成或生理活性作用的調節物，一般在低濃度有促進作用，在高濃度有抑制作用。不少研究表明，對于多粘類芽孢桿菌產多糖，蔗糖是最佳碳源。如劉俊等[19]先用單因素實驗方法篩選影響胞外多糖的產量因子，再用響應面法對碳源、氮源和無機鹽的培養基成分進行優化，最終確定最佳培養基組合為蔗糖188.2g/mL、酵母膏25.8g/mL、氯化鈣0.34g/mL，其提取量高達35.26g/L。蹇華麗等[21]采用單因素實驗法，以多糖產量為指標，對多粘類芽孢桿菌PS04發酵培養基成分進行優化，最終確定蔗糖是最佳碳源，最適濃度150g/L，最佳氮源為無機氮NH4NO3，最適濃度1.4g/L。王波[18]等采用單因素試驗和正交試驗相結合的方法對多粘類芽孢桿菌XZ-2的培養基組分進行優化研究，得出利用蔗糖發酵產糖量最高，其最佳培養基組成為蔗糖15g/L、蛋白胨15g/L、硫酸鎂5g/L、氯化鈣3g/L。
2.2 發酵條件優化 微生物的正常生長繁殖，需要適應的環境。在胞外多糖發酵生產中，除培養基的成分及濃度外，培養溫度、初始pH、發酵時間、通氣量、接種量等工藝條件也是主要的影響因素。只有將這些外界條件控制在適合菌種發酵的最優水平，才能提高多糖的產量。溫度是影響微生物生長的重要因素，它會影響菌中的酶活性，進而會影響微生物體內所進行的各種生化反應，對微生物的影響是最為廣泛的。在一定范圍內，適宜的溫度促進菌體生長，促進代謝活性物質的產生;不適的溫度則會影響微生物的代謝。pH值也會影響菌中酶的活性，直接影響菌類的正常生長和代謝，pH過高或過低均會影響多糖產量。到目前為止，已有不少關于多粘類芽孢桿菌產多糖培養條件的報道。楊樹麗[20]采用單因素試驗法確定了類芽孢桿菌C-12菌株的最佳發酵條件為溫度30℃，初始pH6.0，轉速160r/min，接種量6%。蹇華麗[21]采用單因素法和響應面設計對菌株PS04發酵產多糖的工藝進行優化，最終得出初始pH值為8.22、發酵溫度37℃、接種量4%、發酵周期48h時，多糖產量可達到60.04g/L，約為發酵條件未優化時產量的6倍。表明通過響應面設計方法對發酵條件進行優化可以明顯提高多糖的產率。楊棒棒[22]等在類芽孢桿菌ZX-5產胞外多糖發酵條件優化中，先對碳源、氮源、溫度、pH、碳濃度、氮濃度進行單因素試驗，得出溫度、碳源濃度、氮源濃度對產多糖具有顯著影響，再選用這3個因素進行響應面試驗，分析多糖產量的交互作用，得到最佳的產糖溫度條件為20℃，在優化條件下產糖量達到34.55g/L，是基礎水平的2.01倍。
3 提取與純化
目前，微生物胞外多糖的提取一般采用離心除菌體、有機溶劑沉淀、去除蛋白、透析、冷凍干燥等步驟得多糖粗品，其純度較低，常含有色素、蛋白質和小分子物質等雜質。雜質的存在不僅降低了多糖的純度，也影響對其結構與生物活性的研究。利用凝膠柱層析、離子交換柱層析等手段進行純化，可得到純度較高的多糖樣品。
3.1 提取 多粘類芽孢桿菌多糖為胞外產物，分離過程一般先要去除菌體。高速離心是除菌體最常用的方法。然而，多糖的高粘度性會使發酵液難于離心，因此，有研究者采用先稀釋發酵液再離心的方法，也有研究者在處理發酵液前先加熱發酵液[23]。加熱會使結合在細胞壁上的多糖脫離細胞，同時使蛋白質變性沉淀[24]。因此，發酵液先經熱處理，再冷卻稀釋離心更適合高粘度的多粘類芽孢桿菌發酵液中多糖的提取。用乙醇沉淀是最常用的多糖提取方式[25]。不同菌株發酵液中多糖的提取率與乙醇的濃度有很大影響。如賈杰[26]等用1倍體積的乙醇沉淀多粘類芽孢桿菌HY96-2胞外多糖。田文祥[27]等用3倍體積的95%乙醇沉淀多粘類芽孢桿菌PS04胞外多糖。有機溶劑在低溫下可提高其沉淀量，促進沉淀速度，所以多數研究者使用有機溶劑時先經預處理再沉淀，或是在低溫條件下進行沉淀。
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