來源：江蘇農業學報 2022年3期

　　作者：張小祥;肖寧;張新缽;沈衛華;季紅娟;李育紅;潘存紅;吉春明;吳政;吳云雨;蔡躍;劉建菊;余玲;陳梓春;時薇;張秀琴;劉廣青;周長海;姚友禮;黃年生;李愛宏

　　摘要： 為明確新型小麥種衣劑(JML)對遲播冬小麥幼苗生長及碳、氮代謝相關基因表達的影響，以揚麥23、揚麥24為試驗材料，分析JML包衣處理后遲播冬小麥在種子活力、根系特征、干物質積累及碳、氮代謝相關基因表達等方面的變化特征。結果表明，JML處理后，揚麥23、揚麥24的發芽勢和發芽率顯著提高。莖葉與根器官中干物質積累增加，顯著提高了植株氮積累量。根長、根表面積、根體積及根直徑增加，與對照相比差異顯著。JML處理提高了氮代謝中氮素吸收利用關鍵基因TaNRT1.1、TaNR、TaNIR、TaGS1、TaGS2等在幼苗植株中的表達水平，差異顯著，但顯著抑制了銨態氮轉運蛋白基因TaAMT1.2的表達水平，促進了碳代謝中與光合作用密切相關的 TaClpP 、 TaRBC 、 TaPSB 基因的表達。因此，JML處理可以顯著改善遲播冬小麥的種子活力，提高根系綜合素質，增加苗期硝態氮的吸收轉運、同化水平和葉片的碳同化能力，最終增加苗期植株干物質積累。

　　關鍵詞： 冬小麥; 幼苗; 種子包衣劑; 氮、碳代謝; 基因表達

　　稻麥兩熟是長江中下游區域農作物的主要種植方式 [1] 。近年來，由于水稻品種生育期延遲、騰茬晚，造成稻茬小麥遲播、晚播，影響小麥適期播種，這已成為冬小麥獲得穩產高產的主要障礙 [2-3] 。生產上為了保證群體質量，往往通過增加用種量及增施氮肥的手段來調節，有的地區小麥用種量已經達到350 kg/hm2 ，甚至更高 [4] ，氮肥施用量(純N)則達到270 kg/hm2 [2] ，如此高的用種量與氮肥投入量造成生產成本過高，肥料利用率下降，農業面源污染加重 [5-6] 。另外，在不同地區由于土壤、栽培方式等因素，存在小麥種子出苗率和成苗率不高，苗弱不壯、病害重等生產問題，幼苗素質整體不高，難以達到壯苗入冬，這對小麥越冬及后期生長帶來一系列不利影響，從而最終影響小麥的產量與品質。遲播冬小麥生產中，苗期如何培育健壯的個體，提高苗期群體質量，是目前稻茬冬小麥高產抗逆栽培研究的熱點問題。有研究結果 [7] 表明，通過外源調節劑處理可以一定程度上緩解小麥遲播凍害問題，但對提高遲播小麥種子活力的問題還缺少有效的解決途徑。為解決這一難題，除通過選擇良種及增加用種量外，研發出既能提高種子出苗率和成苗率，又能增加氮素吸收利用的新型小麥種衣劑就顯得極為迫切。

　　硝態氮與銨態氮是小麥根系吸收利用氮素的主要類型，氮同化是小麥吸收氮素的第一階段，并直接關系到植株對氮素的轉運及氨基酸等含氮化合物合成，同時氮素也作為信號調節著植株的生長與發育 [7-9] 。硝態氮在植株體內通過硝酸還原酶( NR )、亞硝酸還原酶( NiR )的作用還原為銨態鹽，銨態鹽繼續在谷氨酸合成酶( GOGAT )、谷氨酞胺合成酶( GS )等主要功能酶作用與調控下參與各種氨基酸等含氮化合物的合成與轉化，從而參與植株體內碳水化合物的形成 [10-14] 。但目前在專用種衣劑或外源生長調節劑作用下植株碳、氮代謝相關基因表達模式尚未見報道。

　　種衣劑是一種包裹于種子表面的肥料農藥復合物，主要包括殺菌劑、殺蟲劑、微量元素和植物生長調節劑等，對作物生長尤其苗期生長具有顯著的正向促進效應，在水稻、玉米等作物上報道較多 [15-18] 。已有研究結果表明，盡管水稻的正向促進效應的大小隨作物品種類型(基因型)不同有差異，但在不同栽培方式下均能夠顯著提高苗期植株的碳、氮吸收能力和植株可溶性蛋白質等含量，促進分蘗發生和干物質積累，為后期高產優質群體的構建奠定基礎 [15] 。新型小麥種衣劑(JML)是江蘇里下河地區農業科學研究所自主研制的小麥專用種衣劑，具有顯著的壯苗、齊苗功能，但對苗期壯苗的相關影響及其內在的調節機制仍不清楚。本研究旨在分析新型小麥種衣劑(JML)在水稻秸稈全量還田下對遲播冬小麥苗期生長效應的影響，以期通過外源種衣劑來調控遲播冬小麥存在個體弱、群體質量不高等難題，對于緩解或解除小麥遲播造成的弱苗與氮素利用率低等問題具有重要意義，為遲播稻茬小麥高產、穩產與苗期抗逆栽培提供理論依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料

　　試驗于2017-2019年連續2年在江蘇里下河地區農業科學研究所試驗基地進行，前茬為水稻。試驗地田塊土質為沙壤土，土壤肥力中等，pH值7.51。耕作層0～ 20 cm，土壤有機質含量19.21 g/kg ，速效磷20.16 mg/kg ，速效鉀62.37 mg/kg ，堿解氮89.27 mg/kg ，全氮1.56 g/kg ，全磷0.98 g/kg ，全鉀12.18 g/kg 。供試品種為揚麥23(YM23，強筋型)、揚麥24(YM24，弱筋型)，種衣劑為新型小麥專用種衣劑(JML)，清水包衣為對照(CK)。

　　1.2 試驗設計

　　該地區當年正常播期為10月25日，本試驗播期為11月15日，遲播21 d，用種量127.5 kg/hm2 。以品種為主區，種衣劑處理為裂區。每品種分別進行JML包衣處理和清水包衣對照處理，每處理30 m 2 ，重復3次，隨機區組排列。所有水稻秸稈全量還田，總施氮量(純N)270 kg/hm2 ，其中基肥、追肥各50%，磷肥(P2 O5 )和鉀肥(K2 O)各105 kg/hm2 ，磷肥和鉀肥全部作基肥，其他管理措施同當地大田生產。包衣參照張小祥等 [15-16] 作物種子包衣的制作方法進行。

　　1.3 測定項目與測定方法

　　1.3.1 種子活力調查 參照國家標準農作物種子檢驗規程(GB/T3543.4-1995)的方法，并略有改進，進行小麥種子發芽試驗 [19] 。在智能光溫培養箱(型號：GZP250A)中用營養缽進行種子活力測試，營養缽高11.8 cm，外徑14.4 cm，內徑13.5 cm，內裝水分飽和土壤1 200 g，每營養缽播正常小麥種子50粒，每處理播4缽，重復3次。設置常溫和低溫2種溫度處理，常溫處理：白天8∶00至 18∶00 溫度控制在25 ℃，夜間18∶00至 第2 d 8∶00 溫度控制在20 ℃;低溫處理：白天8∶00 至18∶00 溫度控制在20 ℃，夜間18∶00 至第2 d 8∶00 ，溫度控制在15 ℃。測定種子發芽率( GP )，發芽勢( GE )和活力指數( SVI )，其中 GP =7 d內總發芽粒數/總粒數×100%; GE =3 d內總發芽粒數/總粒數×100%; SVI = GP× S ， S 為發芽結束后正常植株的干物質質量。

　　1.3.2 干物質質量與吸氮量測定 發芽后每隔7 d，連續28 d，每處理分別取60株長勢一致的幼苗，分為地上部與根系兩部分，烘箱中106 ℃殺青42 min，于85 ℃持續烘干至恒質量后分別稱各部位干物質質量。植株干物質質量=地上部莖葉干物質質量+地下部根系干物質質量。

　　在第22 d和第30 d，分別取100株長勢一致的幼苗，將植株殺青、烘干后研磨成粉末，每個樣品取0.5 g置于消煮管中，使用濃硫酸定氮催化劑進行消煮，用全自動凱氏定氮儀(型號：FOSS Kijeltec 8400)測定植株莖、葉中含氮量。氮積累量=干物質質量× 含氮量。

　　1.3.3 根長、根平均直徑及根表面積測定 每處理在不同時期取60株長勢一致的幼苗，采用全自動根系掃描分析儀進行掃描，然后用根系分析系統(北京澳作生態儀器有限公司產品)分析總根長、根體積、根系平均直徑和根表面積。

　　1.3.4 不同器官總RNA的提取 在四葉一心期將小麥幼苗分為地上部和地下部，每個樣本3次重復。在冰上快速分別取新鮮的葉片和根系，用錫箔紙在冰上進行包裹后，立即放入盛有液氮的泡沫盒中冷凍。在超凈工作臺采用Trizol試劑法提取葉片和根系中總RNA，通過Tiangen試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司產品]將RNA反轉錄成單鏈cDNA。

　　1.3.5 引物的設計與合成 按照熒光實時定量qRT_PCR引物相關設計原則，利用Beacon designer 7.0 軟件設計與目的基因相關的特異性引物。以小麥植株內 TaActin 基因的表達水平作為內參 [14] ，試驗所用引物見表1。

　　1.3.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 參照TaKaRa SYBR Green II定量試劑盒的說明書進行qRT-PCR反應體系的配置，qRT-PCR采用CFX96 TM 實時熒光定量PCR儀(美國伯樂公司產品)進行。定量總反應體系為11 μl，其中引物為2 μl，模板cDNA為1 μl，MIX混合液為4 μl，去RNA酶水為4 μl，重復3次，樣品處理重復3次。基因表達量計算方法：目的基因相對表達量=2 -△△ Ct ，其中，△△ Ct =樣品基因△ Ct - 參比樣品△ Ct ，樣品基因△ Ct =內參基因 Ct - 目的基因 Ct ，參比樣品△ Ct =參比樣品內參基因 Ct - 參比樣品目的基因 Ct 。

　　1.3.7 數據處理 2年數據變化規律一致，本研究選擇2018-2019年度試驗數據進行分析。試驗數據采用Sigmaplot 10.0作圖，采用SPSS Statistic 22軟件進行方差分析，各處理的比較采用最小顯著差數測驗法(LSD)。

　　2 結果與分析

　　2.1 新型小麥種衣劑JML對小麥種子活力的影響

　　種子活力指數是種子發芽速率特征和具體生長量的綜合反映，是作物種子萌發質量的重要指標。從表2中可以看出，新型小麥種衣劑JML處理后，常溫下兩品種間發芽趨勢一致，發芽勢、發芽率較空白對照(CK)平均提高11.67%和5.67%，差異顯著( P < 0.05)，活力指數較對照平均增幅26.98%，達顯著水平。在低溫處理下，兩品種的發芽勢、發芽率較CK平均提高5.50%和8.67%，差異顯著( P < 0.05)。表明新型小麥種衣劑JML能夠明顯提高遲播冬小麥在常溫和低溫下的種子活力，增加出苗率，可減少用種量。

　　2.2 新型小麥種衣劑JML對小麥幼苗干物質積累的影響

　　苗期干物質積累的快慢在一定程度上反映了植株生長勢的強弱，在小麥遲播條件下苗期干物質積累的快慢尤為重要。從圖1中可以看出，兩品種間變化趨勢一致。在幼苗期JML處理過的幼苗莖葉及根器官干物質積累在第7 d、第14 d、第21 d及第28 d均超過同期對照，莖葉超過對照12.84%、14.43%、11.38%及12.94%，根超過對照12.75%、13.89%、15.83%和15.42%，差異均達極顯著水平( P < 0.01)。表明JML有效促進了遲播小麥在幼苗階段地上部、地下部干物質的積累，提高了植株苗期的綜合素質，利于壯根壯苗。

　　2.3 新型小麥種衣劑JML對小麥幼苗氮素積累的影響

　　氮積累量的大小與植株生長程度密切相關。從表3中可以看出，JML處理后，兩品種植株地上部吸氮量變化趨勢一致，在第22 d、第30 d植株整體氮積累量較空白對照(CK)平均提高14.00%和10.96%，差異顯著( P < 0.05)，但植株含氮量并沒有顯著變化( P > 0.05)。表明JML處理能夠明顯提高植株的干物質質量，進而提高遲播冬小麥植株的整體氮積累量，從而利于植株生長，增強苗期抗逆性。

　　2.4 新型小麥種衣劑JML對小麥幼苗根系形態的影響

　　JML處理對小麥幼苗地下根系生長產生了明顯的正向促進作用(圖2)。從根系平均根長來看，隨著生育進程的推移，兩品種在第3 d、第6 d、第9 d、第12 d及第15 d的單株根系平均根長超過對照18.12%、30.72%、18.38%、18.85%及21.68%，差異達顯著水平( P < 0.05)(圖2A)。根系表面積平均顯著增加14.16%、21.32%、16.53%、14.19%和15.75%(圖2B)。根系平均直徑平均超過對照11.77%、8.86%、12.64%、13.24%和10.09%(圖2C)，差異均達顯著水平( P < 0.05)。根體積平均超過對照18.78%、10.25%、10.24%、14.43%和32.45%(圖2D)，差異均達顯著水平( P < 0.05)。上述結果表明，JML處理顯著增加了遲播小麥幼苗的根系整體素質。

　　2.5 新型小麥種衣劑JML對氮轉運基因 TaNRT 、 TaAMT 表達的影響

　　JML處理顯著提高了氮轉運蛋白 NRT 、 AMT 基因的表達水平(圖3)。對于硝態氮(NO-3 -N)中的氮轉運，JML處理后轉運TaNRT1.1基因在葉片中表達水平平均提高1.35倍，差異顯著( P < 0.05)，而在根中表達水平與CK相比顯著下降2.31倍( P < 0.05)，從數值大小來看JML處理后 NRT 在根與莖的整體組合中顯著超過CK(圖3)。對于銨態氮(NH+4 -N)轉運，JML處理后轉運蛋白TaAMT1.2在根中的表達量顯著低于CK，兩品種平均降幅為1.89倍( P < 0.05)，而在莖葉中其表達量與CK在兩品種間差異均不顯著( P > 0.05)。另一硝態氮轉運蛋白家族基因TaNRT2.1、TaNRT2.2在兩品種中變化趨勢一致，JML處理后在根系與葉片中表達量均顯著上調(圖3)。這些差異表明JML處理后具有促進植株對不同形態氮素選擇性吸收，促進了硝態氮在莖葉中的高效轉運，但抑制了銨態氮在根系中的轉運，這種差異應該與植株體內氮轉運復雜的調節系統有關。

　　2.6 新型小麥種衣劑JML對氮同化過程中硝酸還原酶基因( TaNR )、亞硝酸還原酶基因( TaNIR )表達的影響

　　硝態氮吸收后轉運輸送至植株各器官進行同化作用，首先在硝酸還原酶( NR )的作用下轉化為亞硝酸根，亞硝酸根接著在亞硝酸還原酶( NIR )的催化下生成銨根離子，而 NR 是這一階段的關鍵限速酶。本研究發現JML處理后 TaNR 基因在植株根和葉片中均能檢測到表達，JML處理與對照在根中的表達水平差異不顯著( P > 0.05)，但在葉片中JML處理較對照增幅平均為4.34倍，差異顯著( P < 0.05)(圖4)。從絕對值來看， TaNR 在植株中表達量占比優勢從根中轉至葉片中，暗示硝酸鹽同化為亞硝酸鹽過程中的高效化。另外， TaNIR 表達水平的變化與 TaNR 變化趨勢一致，在根、葉片中均有表達，且兩品種均在葉片中表達水平最高(圖4B)，表明亞硝酸鹽向銨鹽轉化過程中的高效流暢性。

　　2.7 新型小麥種衣劑JML對氮利用基因TaGS1、TaGS2表達的影響

　　銨態氮需要在谷氨酰胺合成酶基因1(GS1)、谷氨酰胺合成酶基因2(GS2)的作用下生成谷氨酰胺，谷氨酰胺是進行其他小分子代謝的底物。從圖5中可以看出，JML處理后根系中TaGS1的表達水平顯著下降，差異顯著( P < 0.05)，但在莖葉中表達水平未下降，與CK無顯著差異( P > 0.05)。

　　從圖5中可以看出，基因TaGS2屬于組成型表達，在根中表達量極低，但在葉片中高效表達。JML處理后TaGS2在兩品種葉片中均顯著上調，與CK均差異極顯著( P < 0.01)。TaGS1、TaGS2的表達趨勢不一致，推測可能與GS1主要為胞質型，而GS2為葉綠素型有關，兩者受不同的氮代謝通路所調控。

　　2.8 新型小麥種衣劑JML對碳代謝途徑基因 TaClpP 、 TaPSB 和 TaRBC 表達的影響

　　光合作用是植物利用光能，同化CO2 制造碳水化合物的主要過程。光合基因 TaClpP 固定在葉綠體器官中，主要在小麥特定發育階段表達。從圖6中可以看出，JML處理后， TaClpP 在根中表達微量，品種間差異不大( P > 0.05)，而在葉片中則表達水平較高，表達量與對照相比差異顯著( P < 0.05)。

　　TaPSB (光合系統b)基因和 TaRBC (核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶)基因是植物光系統反應中比較重要的2個基因，與CO2吸收與同化密切相關。從圖7可以看出，在CO2 吸收與同化過程中 TaPSB 和 TaRBC 基因具有組成型表達的特點，在兩品種根系中均未檢測到表達，而在葉片中兩者均高效表達。JML處理后小麥苗期葉片表達水平高于對照，差異顯著( P < 0.05)。 TaRBC 是光合作用C3反應中重要的羧化酶， TaRBC 基因表達上調表明JML處理后植株葉片對無機態碳即CO2 的吸收更加高效，加速碳水化合物的形成。

　　3 討 論

　　遲播冬小麥在苗期常伴隨低溫、凍害等不利因素，嚴重影響苗期的小麥群體質量 [3，20] 。合理的苗期群體結構是保障冬小麥實現穩產高產的前期物質基礎，播種期延遲易引起出苗率降低、幼苗素質弱和群體干物質積累下降等問題 [3] 。前人通過加大播種量和增施氮肥等常規解決途徑進行調控，但均不易形成冬前壯苗 [3，21] 。趙紅梅等 [22] 的研究結果表明，旱地小麥逆境栽培通過膜覆土或膜際條播的方式獲得增溫效應使得小麥出苗時間提前，從而增加群體分蘗，促進冬前壯苗。另有研究發現，遲播小麥通過增加用種量能保證產量，但增加了莖稈基部節間長度，影響了株型和群體質量，增加小麥后期倒伏風險 [2] 。本研究結果表明，JML處理小麥種子后顯著提高植株干物質質量與植株氮積累量，培育了健壯個體，能夠增加遲播冬小麥的低溫抗逆能力。種子活力指數是種子群體發芽速率和成苗率特征的綜合反映，是種子能否正常使用的直接體現。沈奇等 [23] 研究發現種衣劑應用在油料作物紫蘇中可以顯著提高紫蘇種子活力，提高出苗率，增加幼苗生長速度。本研究結果表明，JML處理小麥種子后可以顯著提高冬小麥發芽勢、發芽率及種子活力指數等各項關鍵生理指標，增強遲播冬小麥的出苗率和成苗率，促進幼苗生長，減少大田用種量。

　　氮素是影響前期植物群體質量和后期產量形成的關鍵元素，它參與植物體內的重要生理代謝 [24] 。小麥吸收的氮素以硝態氮(NO-3 -N)為主，硝態氮是小麥根系直接吸收與同化的主要氮素形態 [10，25] 。適量的氮肥增施能促進作物地下根系的健壯發育，增加根長、根體積和根質量，促進植株干物質的積累 [24，26] 。本研究結果表明，JML處理有效增大了根長、根直徑、根體積和根表面積，促進了小麥根系的生長，增加對土壤水分與養分的吸收，利于培育壯根。已有研究結果顯示，在秈稻和粳稻苗期轉錄組分析中發現，調控壯苗有關氮素吸收的關鍵 Hub 基因表達水平不同，可能與植株吸收氮素的形態差異有關 [27] 。遲播冬小麥盡管通過增施氮肥可以一定程度上增強幼苗素質，但卻增加田間氮素的損失并降低氮素吸收利用率 [28] 。有研究結果表明，土壤中硝態氮的淋溶深度、淋失量與施氮量密切相關，在施氮量超過160 kg/hm2 的閾值后，硝態氮的淋失程度顯著上升，而氮素吸收利用率顯著下降 [29] 。 NR 是氮同化階段的關鍵限速酶和誘導酶基因，其表達量大小與作物的氮素吸收利用效率高低密切相關 [30-31] 。本研究結果表明，JML處理促進了遲播冬小麥苗期對土壤表層硝態氮的吸收與利用，提高了植株氮積累量，顯著提高了氮代謝中氮素吸收利用關鍵基因TaNRT1.1、 TaNR 、 TaNIR 、TaGS1、TaGS2等在植株中的表達水平，一定程度上降低了苗期氮素的損失，提高了氮素利用率。同時本研究還發現，JML處理抑制了遲播冬小麥根系對土壤表層銨態氮(NH+4 -N)的吸收與利用，銨態氮轉運蛋白TaAMT1.2基因的表達水平在揚麥23、揚麥24品種中顯著降低，但在葉片中的表達水平未有明顯變化。這表明JML處理有助于小麥葉片對硝態氮的選擇利用而降低了銨態氮利用，其內在機制需要進一步深入研究。JML處理促進小麥生長，應該與其含有內生真菌次生代謝產物有關的生物刺激素有關，而生物刺激素屬于植物免疫誘抗劑類型。有研究結果表明，生物刺激素在促進植物生長和增強抗病性方面表現出較高活性 [32-35] ，激發植物體內水楊酸代謝通路，可誘導植株體內活性氧(ROS)積累及相關基因的表達，同時有效增加根尖生長素的含量，調節植株對氮素的吸收，以此促進植物生長 [36] 。

　　推薦閱讀：休閑農業論文寫多少字符合發表要求