摘要：為明確蒙古黃芪苗期立枯病害及其病原菌種類，采用組織分離法進行病原菌分離，并根據其培養性狀、形態學和分子生物學rDNA-ITS特征進行鑒定。結果表明，該病害的病原菌為立枯絲核菌(Rhizotonia solani)。室內致病性測試結果表明，立枯絲核菌可引起蒙古黃芪苗期立枯病。本研究首次報道了蒙古黃芪苗期立枯病及其病原菌，可為生產上該病害的防治提供理論依據。

　　關鍵詞：苗期;蒙古黃芪;立枯病;病原鑒定;致病性測定

　　引言

　　黃芪(Astragalus menbranaceus)是豆科黃芪屬多年生草本植物，有蒙古黃芪(Astragalus menbranaceus var. mongholicus)和膜莢黃芪(Astragalus menbranaceus)[1]，以干燥的根入藥，具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌等功效[2]。蒙古黃芪原產于山西、內蒙、河北、陜西和甘肅等地。甘肅省隴西縣是國內主要的道地黃芪產區之一，具有品質優和產量高等特點，被中國特產組委會命名為“中國黃芪之鄉”。隨著甘肅省黃芪人工栽培面積的逐年擴大、黃芪連作生長環境的改變和土壤病原菌數量的不斷積累，黃芪病害已成為制約其產量增加和品質提升的重要因素之一。

　　關于黃芪的一些病害國內學者有研究。陳宏宇等[3]對黃芪根腐病的發病因素進行調查，結果發現，溫濕度、土壤質地、茬口對黃芪根腐病的發生都有一定的影響，連作是黃芪根腐病發生的主要因素之一，輪作對根腐病的防治作用明顯。據報道[4-9]黃芪根腐病的主要病原菌為尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysporium)、茄病鐮孢菌(Fusariumsonali)、銳頂鐮刀菌(Fusarium acuminatum)、芬芳鐮刀菌(Fusarium redolens)、鏈格孢菌(Alternaria sp.)和Ilyonectria torresensis等。駱得功等[10]、陳泰祥等[11]和陳秀蓉等[12]對甘肅省隴西縣幾個重病區的黃芪霜霉病病原菌鑒定為黃芪霜霉菌(Peronospora astragalina)。任舉[13]報道，黃芪葉部的銹病由單孢銹菌屬(Uromyces)真菌引起。李綏峰[14]、孫樹文等[15]、徐福祥[16]、邢占民[17]、周天旺等[18]和陳泰祥等[19]對黃芪白粉病的發生特點、發生規律、病原種類及防治進行了研究。馬瑩瑩等[20]系統總結了黃芪主要病害的發生情況、致病菌種類的多樣性、抗病品種選育、栽培管理模式、土壤營養、化學防治和生物防治等，為黃芪病害的綜合防治提供了參考。關于立枯絲核菌引起的黃芪根病有報道，但由其引起的苗期黃芪立枯病未見報道。因此，筆者對定西市苗期發生的黃芪立枯病的發病癥狀進行研究，以確定其病原種類和致病性，為苗期黃芪立枯病的田間防治提供理論依據。

　　1材料與方法

　　1.1病樣采集及田間病害分級

　　在定西市農業科學研究院黃芪種植基地，采集苗期黃芪立枯病發病植株，記錄采集信息后裝入自封袋。采用5點取樣法進行田間調查，每點30株。病害分級標準為：0級—根部無病斑，1級—根部病斑面積占總根部面積的1/4以下，3級—根部病斑面積占總根部面積的1/4～1/2，5級—根部病斑面積占總根部面積的1/2～3/4，7級—根部病斑面積占總根部面積的3/4以上。

　　1.2病原菌分離

　　采用常規組織分離法[21]，無菌條件下剪取病健交界處組織塊5 mm×5 mm置于75%酒精中浸泡5 s，然后轉移至1.5%次氯酸鈉溶液中消毒1 min，無菌水漂洗3次晾干，置于PDA培養基平板內于25℃培養5～7天。將分離純化的菌株轉接至PDA斜面，4℃保存備用。

　　1.3病原菌形態學鑒定

　　將病原菌接種在PDA培養基上，25℃下培養7天后，觀察并拍照記錄菌落形態、顏色、產孢結構及孢子大小。根據魏景超[22]的分類方法和標準進行病原菌種類鑒定。

　　1.4病原菌分子生物學鑒定

　　1.4.1真菌基因組DNA提取刮取PDA培養基上的病原菌菌絲，按照真菌基因組DNA快速抽提試劑盒E.Z. N.A HP Fungal DNA Kit(OMEGA)的步驟提取DNA，保存于-20℃備用。

　　1.4.2分子鑒定的引物試驗采用真菌核糖體基因ITS區域引物D1和D2，引物序列分別為ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4-R(TCCTCCG CTTATTGATATGC)。

　　1.4.3 PCR擴增、凝膠電泳、測序及序列分析PCR擴增體系(20μL)：2×Taq PCR SuperMix 10μL，10μmol/L正反向引物各1μL，DNA模板1μL，用ddH2O補足至20μL。PCR反應條件：94℃預變性2 min;94℃變性20 s，50℃退火10 s，72℃延伸30 s，35個循環;72℃延伸2 min，4℃保存備用。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

　　1.4.4 rDNA序列比較分析與系統發育樹使用BioEdit校對測序結果并拼接序列。測序后的序列經校正后，在核酸序列數據庫GenBank中進行同源序列搜索，比較測試菌株與數據庫中相應序列的相似程度，獲得同源性較高的立枯絲核菌ITS序列，應用DNAMAN進行序列比對分析，并用Mega 6.0 Neighbor-joining法構建系統發育樹。

　　1.5病原菌致病性測定

　　采用柯赫氏法則進行致病性測定，將滅菌土裝入高和直徑都為15 cm的花盆中，挑選大小一致且無病斑的黃芪苗3株移栽，共移栽6盆。待黃芪莖稈長至6 cm時撥開花盆上部8 cm土壤，將分離純化的病原物打成10 mm菌餅，分別做針刺和無刺傷接菌，以未接菌PDA培養基為對照，每株接1個菌餅，回填土壤澆水。50天后調查發病情況，同時將發病部位再次分離培養，通過形態學和分子生物學鑒定確定分離得到的病原菌與初接病原菌是否為同一病原菌。

　　2結果與分析

　　2.1發病癥狀

　　田間調查發現，苗期黃芪立枯病在6月上旬發病，8月進入發病盛期。地上部發病植株長勢衰弱，葉色灰綠，失水狀，少數葉片枯萎，提前脫落(圖1a)。根莖部產生不規則形黑褐色網狀病斑，圍繞整個根莖，病斑不凹陷(圖1b)。

　　2.2形態學鑒定特征

　　在PDA培養基上(圖2a～b)，菌落初為白色，逐漸變為淡褐色至深褐色，菌落中間較密，邊緣稀疏。3～4天形成“菌核”，菌核初為白色，后變紫褐色至深褐色。初生菌絲無色，粗細較均勻，直徑4.98～8.79μm，分枝呈直角或近直角，分枝處大多有縊縮(圖2c)，附近生有一隔膜。

　　2.3核糖體rDNA-ITS序列分析

　　測序結果與GenBenk數據庫中進行Nucleotide Blast比對，與立枯絲核菌的ITS片段同源性達100%。用Mega 7.0軟件，采用鄰接法構建系統發育樹，黃芪立枯病與Rhizoctonia solani親緣關系最近(圖3)。結合形態學和分子生物學特征，將引起黃芪立枯病的病原菌鑒定為立枯絲核菌(R. solani)。

　　2.4致病性測定

　　室內致病性測試結果(圖4)表明，接菌植株表現出與自然病株相同的癥狀，未接菌植株表現正常，從接種發病黃芪植株上全部分離到病原菌，形態學和分子生物學鑒定為立枯絲核菌。

　　3討論

　　植物病害病原種類的確定是防治的前提和基礎，明確病原種類對制定合理的防治策略和提高防治效果有重要的指導作用。本試驗首次報道了苗期黃芪立枯病的發病癥狀，同時明確了該病害的病原菌為立枯絲核菌。