摘要：利用酶聯(lián)免疫吸附法原理建立了一種能夠定量測(cè)定果蔬、茶葉、煙葉中多菌靈殘留量的方法。通過(guò)酸堿中和化學(xué)反應(yīng)，制備多菌靈半抗原，再通過(guò)免疫小鼠篩選出抗多菌靈單克隆抗體，制得酶標(biāo)羊抗鼠抗抗體，并將制備出的抗多菌靈單克隆抗體和酶標(biāo)羊抗鼠抗抗體用于酶聯(lián)酶聯(lián)免疫試劑盒的研制。結(jié)果表明，在0.1~8.1 ug/L的線性范圍內(nèi)，目標(biāo)物多菌靈線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)

　　可達(dá)到0.995。在300，600，1 200 ug/kg 3個(gè)添加水平下試劑盒的回收率為76.0%~102.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。試劑盒栓測(cè)煙葉、蘋果、白菜、茶葉樣本中的多菌靈，檢測(cè)限依次為266.3，421.0，349.1，484.4 pg/kg(n=20)。該方法屬于快速檢測(cè)方法，適用于果蔬、茶葉、煙葉中多菌靈殘留量的測(cè)。

　　關(guān)鍵詞：多茵靈;單克隆抗體;ELISA試劑盒

　　Abstract: Using the principle of enzyme-linked immunosorbent assay, a method for quantitative determination of carbendazim residues in fruits, vegetables, tea, and tobacco was established.

　　First, the carbendazim hapten was prepared through acid-base neutralization chemical reaction, and then the antrcarbendazim monoclonal antibody was screened out by immunizing mice to prepare the enzyme-labeled goat anti-mouse anti-antibody, and finally the prepared anti-carbendazim Monoclonal antibodies and enzyme-labeled goat anti-mouse antrantibodies were used in the development of enzyme-linked ELISA kits. The results showed that within the linear range of 0.1~8.1 ug/L., the target carbendazim had a good linear relationship, and the correlation coefficient (R2) could reach 0.995. The recoveries of the kits at the addition levels of 300, 600, and 1 200 g/kg were 76.0%~102.2%, and the relative standard deviations were all less than 10%. The kit detected carbendazim in tobacco leaves, apples, cabbage, and tea samples, and the detection limits were 266.3,421.0, 349.1, and 484.4 ug/kg (n = 20). This method was a rapid detection method and suitable for the determination of car bendazim residues in fruits, vegetables, tea, and tobacco leaves.

　　Keywords: carbendazim: monoclonal antibodies; enzyme linked immunosorbent assay kit

　　多菌靈(carbendazim)即N-2-苯并吡唑基)氨基甲酸甲酯，屬于苯并呲唑類，是一種病害防治殺菌劑，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物。然而施用多菌靈的目標(biāo)物會(huì)長(zhǎng)期殘留該藥物，人、畜食用后，會(huì)引起頭暈、惡心、嘔吐、抽搐等一系列中毒癥狀[-2].

　　GB 2763-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定了果蔬、茶葉中多菌靈的最大殘留限量(Maximum Residue Limit，MRL)范圍為：0.02 ~5.00 mg/kg。目前中國(guó)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有：GB/T 5009.188-2003《蔬菜、水果中甲基托布津、多菌靈的測(cè)定》、GB/T23380-200%水果、蔬菜中多菌靈殘留的測(cè)定 高效液相色譜法》，SN/T 3650-2013《藥用植物中多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈殘留量的測(cè)定 液相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法》、SN/T 0162-2011《出口水果中甲基硫菌靈、硫菌靈、多菌靈、苯菌靈、噻菌靈殘留量的檢測(cè)方法 高效液相色譜法》、SN/T 1753-2016《出口濃縮果汁中甲基硫菌靈、噻菌靈、多菌靈和2-氨基苯并咪唑殘留量的測(cè)定 液相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法》、SN/T 0220-2016《出口水果中多菌靈殘留量的檢測(cè)方法》、NY/T 1680-2009《蔬菜水果中多菌靈等4種苯并咪唑類農(nóng)藥殘留量的測(cè)定 高效液相色譜法》、NY/T 1453-2007《蔬菜及水果中多菌靈等16種農(nóng)藥殘留測(cè)定 液相色譜一質(zhì)譜一質(zhì)譜聯(lián)用法》。上述標(biāo)準(zhǔn)均為儀器分析法，同時(shí)，通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，前人研究多菌靈檢測(cè)方法較多地偏重儀器方法，已報(bào)道的儀器方法有：超高效液相色譜法[3]、QuEChERS-高效液相色譜法(-3]、液相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法[6]、紫外分光光度法["]、液相色譜法-]、高效液相色譜法[o-1，、SERS法[2]等，分析對(duì)象主要為蔬菜、水果。此外，也有報(bào)道[13-1])利用酶聯(lián)免疫法快速檢測(cè)多菌靈的殘留量，但分析對(duì)象為土壤和水，目前尚未檢索到農(nóng)產(chǎn)品中檢測(cè)多菌靈殘留量的快速檢測(cè)方法。而且儀器分析法成本高、步驟復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)人員有較高的技術(shù)要求，不便于基層實(shí)驗(yàn)室和中小型生產(chǎn)企業(yè)實(shí)施檢測(cè)。因此，研究擬采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)煙葉、蘋果、白菜、茶葉中多菌靈殘留量進(jìn)行檢測(cè)，以期提供一種成本低、效果好的方法，為農(nóng)藥殘留監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

　　1材料與方法

　　1.1 材料與儀器

　　多菌靈、噻苯達(dá)唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑標(biāo)準(zhǔn)品：純度>95%，北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心;牛血清白蛋白：純度>98%，美國(guó)Sigma公司;卵清蛋白：純度>98%，美國(guó)Sigma公司;三氟乙酸、三氟乙酸酐、硝酸銨、氫氧化鈉、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯化錫、碳二亞胺、石油醚、硫化銨、二甲基甲酰胺、碳酸鉀：分析純，北京百欣試劑公司;果蔬、茶葉、煙葉：市售;Balb/c小鼠：斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司;單克隆雜交瘤細(xì)胞株：實(shí)驗(yàn)室自制;酶標(biāo)儀：MK3型，上海雷勃分析儀器有限公司。

　　1.2抗原制備

　　1.2.1 半抗原制備 取三氟乙酸20 mL.加三氟乙酸酐2 mL，冰水浴至0℃，加硝酸銨0.5 g，攪拌1h，加入含多菌靈1.0 g的三氟乙酸溶液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h。停止攪拌，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，加200 ml.

　　二氯甲烷萃取，加水300 mlL，充分?jǐn)嚢瑁D(zhuǎn)入分液漏斗中，靜置30 min，分層，分去上層水相，所得二氯甲烷溶液，旋蒸(40 ℃)，50 mL.乙醚打漿，得到化合物a 0.76 g.收率67%[]。在上述三氟乙酸和三氟乙酸酐體系下，用硝酸銨對(duì)多菌靈進(jìn)行硝化反應(yīng)，在苯環(huán)上引入硝基，萃取前進(jìn)行中和，便于萃取.'H NMR(CDCl，，300 MHz)o：8.31(1H，dd.J=1.616，=1.239)，.7.69(1H，dd，J=8.716，J=1.616)，7.64(1H，dd，J=8.716.J=1.239)，3.85(3H，s)取化合物a 0.7g用乙醇溶解，加含0.43 g氯化錫的水溶液10 mL，通入氮?dú)猓訜峄亓鞣磻?yīng)3h;旋蒸(60 ℃)、除去乙醇，加水200 mlL，加乙酸乙酯100 mL，充分?jǐn)嚢瑁o置，分去水相，有機(jī)相旋蒸(55 ℃)以除去大部分乙酸乙酯，利用石油醚-乙酸乙酯(V石艇：VZ酸乙脂=

　　1：1)對(duì)其進(jìn)行洗脫分離，得到b產(chǎn)物(半抗原化合物)0.54 g，收率為83%.'H NMR(CDCla，300 MHz)0：3.79(3H，s)，6.27(2H，s)，6.90(1H.dd.J=2.225.J=1.850)，6.46(1H，dd.J=8.422.J=2.225)，7.34(1H，dd.J=8.422.1=1.850)，5.00(1H，s)，9.15(1H，s)，上述產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜測(cè)定，在化學(xué)位移8=6.27處存在苯環(huán)上芳香胺的共振吸收峰，說(shuō)明半抗原合成成功。多菌靈半抗原合成路線見(jiàn)圖1.

　　1.2.2 免疫原制備 稱取牛血清白蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mlL.0.1 mol/L，磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)中得到溶液A;用0.2 mL H20溶解1-(3二甲氨基丙基)-3乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-A基琥酰亞胺各30 mg，加入至溶液A中，攪拌30 min;取15 mg半抗原，溶解于1 ml.二甲基甲酰胺溶液中，然后緩慢加入到溶液A中溶解，攪拌24 h。透析后分裝，-20℃保存。

　　1.2.3 包被原制備 稱取卵清蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL.0.1 mol/L，磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)中，得到溶液B;用0.2 mL.H20溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N羥基琥珀酰亞胺各30 mg，加入至溶液B中，攪拌30 min;取13 mg半抗原，溶解于1ml.二甲基甲酰胺中，然后緩慢加入到溶液B中溶解，攪拌

　　24 h，透析后分裝，-20℃保存。

　　1.3 酶標(biāo)記抗抗體制備

　　利用1.2得到的免疫原免疫Balb/c，制備雜交瘤細(xì)胞株，純化出多菌靈單克隆抗體[1]，免疫無(wú)病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體[7，再用辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行標(biāo)記[]，得到標(biāo)記抗抗體。

　　1.4 抗原包被濃度、單克隆抗體濃度選擇及酶標(biāo)板制備(1)備抗依次進(jìn)行1：2 000.1：4 000，18000的梯度稀釋，對(duì)制備的單克隆抗體依次進(jìn)行1：10 000，1：20 000，1：40 000，1：80 000的梯度稀釋，測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm，按式(1)計(jì)算百分吸光率。к-× 100%，

　　(1)式中：K--百分吸光率，%;B--標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液的平均吸光度值;B--0 ug/L，標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

　　(2)包被酶標(biāo)板的抗原包被液體積為100 pL，需在37℃下孵育2h，再加入150 pL 0.02 mol/L PBS緩沖液，其中牛血清白蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%，37℃下孵育2 h[13]，即完成酶標(biāo)板制備。

　　1.5 煙葉中多菌靈殘留量測(cè)定

　　利用RIDAWIN數(shù)據(jù)分析軟件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別以待測(cè)藥物的標(biāo)準(zhǔn)品濃度、Logit(B/B，)為標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫、縱坐標(biāo)，將待測(cè)樣本的吸光度值代入該曲線，即可測(cè)定出多菌靈殘留量。

　　1.6 關(guān)鍵指標(biāo)檢測(cè)

　　1.6.1 檢測(cè)限 取20份經(jīng)過(guò)確證的空白樣本，利用1.5的方法檢測(cè)樣本濃度，并計(jì)算20份樣本濃度的標(biāo)準(zhǔn)差，所測(cè)樣本濃度的平均值與其3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和即為檢測(cè)限[00)

　　1.6.2 精密度和準(zhǔn)確度 將多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品添加至煙葉樣本，添加濃度分別為300，600，1 200 ug/kg，檢測(cè)3個(gè)濃度的煙葉樣本回收率。煙葉樣本做4個(gè)平行，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD).

　　1.6.3 穩(wěn)定性 將試驗(yàn)制備的試劑盒于4℃下存放，每月固定日期測(cè)定最大吸光度值(O yg/L)、試劑盒1Cso以及煙葉樣本的回收率，連續(xù)測(cè)定12個(gè)月。

　　1.6.4 抗體特異性 噻苯達(dá)唑、甲基托布津、托布津、

　　2-氨基苯并咪唑與多菌靈的結(jié)構(gòu)類似，測(cè)定上述藥物的ICso，根據(jù)式(2)計(jì)算噻苯達(dá)唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑的交叉反應(yīng)率。引起50%抑制的多菌靈濃度與引起50%抑制的多菌靈類似物濃度的百分比，即為交叉反應(yīng)率。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1 抗原包被濃度、單克隆抗體濃度選擇測(cè)定濃度為0.0.0.1 yg/L的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值(見(jiàn)表1)，根據(jù)式(1)計(jì)算B(0.1 ug/L)/B，(0.0 g/L)

　　的百分吸光率。理論上在抗原數(shù)量一定的情況下，抗體只有達(dá)到一定數(shù)量才能有效結(jié)合，然而實(shí)際應(yīng)用中，抗原和單克隆抗體作為制備酶聯(lián)免疫試劑盒的最關(guān)鍵原料，理想情況是在能夠保證有效反應(yīng)的情況下，抗體量最小;稀釋倍數(shù)越大，同樣產(chǎn)量的原料能夠制備的試劑盒就越多。根據(jù)已有的研究[2]，如果能夠達(dá)到B(0.1 1g/L)/B

　　(0.0 yg/L)的百分吸光率在70%~85%的要求，那么稀釋倍數(shù)越大，原料就能節(jié)省得越多。因此，選擇抗原稀釋倍數(shù)為8000，單克隆抗體稀釋倍數(shù)為80 000。

　　2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　利用RIDAWIN數(shù)據(jù)分析軟件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖2)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為0.0~8.1 ug/L，試劑盒的半數(shù)抑制濃度(ICso)為0.851 ug/L;得到的線性方程為：y=-1.686x+1.117，決定系數(shù)R2為0.995.

　　2.3 檢測(cè)限

　　由表2可知，該方法對(duì)煙葉、蘋果、白菜及茶葉樣本的檢測(cè)限分別為266.3，421.0，349.1，484.4 ug/kg。優(yōu)于吳燕等[2]針對(duì)茶葉建立的基于表面增強(qiáng)拉曼光譜測(cè)定方法(定量限為2000 g/L)，GB 2763-2019食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定了多菌靈對(duì)蘋果、白菜、茶葉的最大殘留限量均為5 mg/kg(暫未對(duì)煙葉進(jìn)行規(guī)定)。因此，該方法能夠滿足對(duì)多菌靈的檢測(cè)要求。

　　2.4 精密度和準(zhǔn)確度

　　由表3可知，不同添加水平多菌靈的煙葉樣本的回收率為76.0%～102.2%，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 4.8% ～9.7%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.0%～8.6%。酶 聯(lián) 免 疫 試劑盒的準(zhǔn)確性與 精 密 度 有 關(guān)，批內(nèi)與批間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以內(nèi)，能保證測(cè)試的準(zhǔn)確性。

　　2.5 穩(wěn)定性

　　由表4可知，試劑盒于4 ℃保存能夠正常檢測(cè)12個(gè) 月，試驗(yàn)期間其最大吸光度值 (0μg/L)范 圍 為 1.59～1.91，IC50范圍為0.367～0.772μg/L，煙葉樣本的回收率范圍為72.6%～95.3%，均未顯示異常。說(shuō)明該酶聯(lián)免疫試劑盒的穩(wěn)定性良好，在4 ℃下能夠保存12個(gè)月。

　　2.6抗體特異性

　　噻苯達(dá)唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑?yàn)閼?yīng)用廣泛的殺菌劑。通過(guò)測(cè)定多菌靈抗體與噻苯達(dá)唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑的交叉反應(yīng)率，發(fā)現(xiàn)多菌靈抗體與噻苯達(dá)唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑的交叉反應(yīng)率<1%，說(shuō)明多菌靈抗體的特異性良好。

　　3結(jié)論

　　試驗(yàn)建立了一種煙葉、蘋果、白菜、茶葉中多菌靈殘留的酶聯(lián)免疫吸附方法，通過(guò)制備出特異性良好的多菌靈單克隆抗體，將其應(yīng)用于酶聯(lián)免疫試劑盒的制備。結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定性好，檢測(cè)時(shí)間僅為45~60 min，并且不需要昂貴的儀器，適用于基層實(shí)驗(yàn)室對(duì)煙葉、蘋果、白菜、茶葉中多菌靈殘留量進(jìn)行批量檢測(cè)。GB 2763-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定了多菌靈對(duì)6種谷物、4種油料油脂、16種蔬菜、28種水果等食品類別的最大殘留限量，而試驗(yàn)研究樣本僅限于蘋果、白菜等果蔬，今后可根據(jù)市場(chǎng)需求，結(jié)合該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣本進(jìn)行拓展。

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文章名稱： 一種多菌靈酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)方法的建立

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