〔摘要〕 目的 通過觀察益氣活血中藥組方加味丹參飲(JWDS)對心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI)模型大鼠血清硫化氫(H2S)合成酶/胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyse， CSE)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes， CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， DH)含量、心肌組織超微結構、心肌組織CSE mRNA表達的影響，從內源性H2S合成途徑探討JWDS治療MIRI的作用機制。方法 給藥組大鼠按劑量6.19 g/(kg·d)要求給藥14 d，末次給藥2 h后采用結扎冠脈左前降支/再灌流方法復制MIRI模型。HE染色觀察心肌組織機構改變情況;ELISA法檢測血清CK、LDH、CSE含量;Western-blot檢測心肌組織CSE蛋白表達;Real-time PCR檢測心肌組織CSE mRNA表達。結果 JWDS可明顯改善MIRI模型大鼠心肌組織病理改變，降低血清LDH、CK含量(P<0.01)，升高CSE含量(P<0.01)，上調心肌組織CSE及mRNA表達(P<0.05，P<0.01)。PPG可明顯降低JWDS組大鼠血清CSE含量(P<0.01)，下調心肌CSE mRNA表達(P<0.01)。結論 JWDS對實驗性心肌缺血/再灌注(MIR)大鼠心肌損傷具有明顯保護作用，其機制與促進內源性H2S生成從而保護心肌細胞結構，抑制CK、LDH漏出，上調心肌組織CSE蛋白及mRNA表達有關。

　　〔關鍵詞〕 心肌缺血再灌注;加味丹參飲;益氣活血; H2S;CSE

　　心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI)是指心肌缺血后冠狀動脈再通，恢復供血后導致的復雜心肌損傷反應，是導致溶栓治療、心臟移植及冠脈搭橋等治療手段失敗的主要原因[1-4]。MIRI可導致包括再灌注性心律失常、心肌頓抑、血液無復流、微血管內皮細胞損傷以及微循環障礙等在內的一系列功能、結構、代謝方面的損傷，臨床治療心血管疾病應盡量避免MIRI帶來的負面作用，對MIRI的臨床表現、發病機制以及防治途徑的研究具有重要意義[5-6]。硫化氫(H2S)是一種類似于一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)的內源性氣體信號分子，主要由胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyse， CSE)催化底物L-半胱氨酸生成[7]。研究發現H2S可自由穿過細胞膜，是細胞防御的內源性機制，外源性H2S干預對離體心臟缺血預處理具有明顯的保護作用[8]。

　　加味丹參飲(JWDS)是跟據大量臨床經驗，從《時方歌括》丹參飲化裁而來，由黃芪、丹參、檀香、川芎、赤芍等組成，全方共奏益氣活血之功，在臨床上對防治冠心病心絞痛有很好的療效。部分研究證實該方可通過調控細胞凋亡、抗炎等有效途徑的減輕心肌缺血再灌注損傷。但其多環節、多靶點作用的確切機制還未完全闡明。為探究是否通過內源性H2S調節通路對MIRI發揮治療作用，本實驗通過觀察加味丹參飲JWDS對MIRI模型大鼠心肌組織細胞形態、血清合成酶/胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyse， CSE)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes， CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， DH)含量、心肌組織CSE及mRNA表達的影響，以及H2S合成酶抑制劑PPG對JWDS治療效果的影響，進一步闡釋JWDS保護MIRI的作用機制。

　　1 材料

　　1.1 動物

　　SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質量(200±20)g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證編號：SCXK(湘)2014-0008。

　　1.2 主要藥物與試劑

　　加味丹參飲(由丹參、檀香、赤芍、川芎、當歸、紅花、生地黃、黃芪等組成)，湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供;LDH、CK、CSE ELISA試劑盒均購于武漢基因美生物，批號201804;硫氫化鈉(NaHS)，美國Sigma公司;RIPA(強)組織細胞快速裂解液(批號PAB180006)、Goat-anti-rabbit IgG二抗(批號PAB150011)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號PAB180007)均購于BIOSWAMP公司;Anti-rabbit CSE抗體(批號Ab80643)、Anti-rabbit抗β-Actin抗體(批號Ab8227)均購于美國Abcam公司;Trizol試劑(批號15596026)，ambion公司;YBR Green PCR試劑盒(批號KM4101)，KAPA Biosystems公司;逆轉錄試劑盒(批號639505)，TAKARA公司。

　　1.3 儀器

　　小動物呼吸機(DW-3000，淮北正華生物儀器設備有限公司);FX-211小動物心電圖機(北京福田電子醫療儀器有限公司);MK3型酶標儀(芬蘭雷勃);AC8型自動洗板機(Thermo公司);TG16W型微量高速離心機(湖南湘儀);GNP-9080型隔水式恒溫培養箱(上海精宏);mini protean 3 cell型電泳儀、Real-time PCR、Universal Hood Ⅱ型凝膠成像系統(美國BIO-RAD);K30型干式恒溫器(杭州爽盛儀器);Centriguge 5424 R型離心機(德國Eppendorf);Tanon-5200型ECL分析儀(上海天能)。

　　2 實驗方法

　　2.1 分組與給藥

　　取SD大鼠70只，按體質量隨機分為空白組、假手術組、MIRI模型組(MIRI組)、缺血預適應組(IP組)、NaHS+MIRI組(NaHS組)、加味丹參飲+MIRI組(JWDS組)、加味丹參飲+PPG+MIRI組(JWDS+PPG組)，每組10只。JWDS組與JWDS+PPG組每日以加味丹參飲(6.19 g/kg)灌胃，JWDS+PPG組于再灌注前30 min以CSE合成酶抑制劑PPG(33.9 mg/kg)腹腔注射干預，NaHS組以28 μmol/kg NaHS腹腔注射，空白組、假手術組、MIRI、IP組以等量生理鹽水灌胃，給藥體積均為10 mL/kg。每日給藥1次，連續14 d。

　　2.2 缺血再灌注模型建立

　　末次給藥2 h后建立MIRI模型。除空白組外，各組大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于解剖臺上，頸部備皮消毒。切開氣管，以8號灌胃針進行氣管插管，動物呼吸機(呼吸頻率60～80次/min，潮氣量5～7 mL)輔助呼吸。沿第3/4肋骨上緣打開胸腔暴露心臟，剪開心包，沿冠狀動脈于左前降支下方約2 mm處用無創縫合線結扎冠狀動脈，連續監視心電圖的變化，出現ST段弓背抬高，T波高聳/倒置或左心室變為蒼白色即確認阻斷成功。30 min后放松結扎線，再灌注90 min以ST 段回落1/2以上，T波下降或左心室由蒼白變為暗紅色表示再灌注成功。假手術組僅做開胸處理，不結扎。

　　2.3 HE染色觀察心肌組織病理變化

　　取大鼠心肌組織，10%多聚甲醛浸泡固定，石蠟包埋，間斷連續切片，HE染色，正置顯微鏡下觀察心肌組織病理變化并拍照。

　　2.4 ELISA檢測大鼠血清CSE、CK、LDH含量

　　大鼠心肌缺血/再灌注24 h后，脫頸處死大鼠，腹主動脈取血，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清，分裝后置于-20 ℃冰箱凍存備用。參照ELISA試劑盒說明，檢測血清CSE、CK、LDH含量。

　　2.5 Western blot檢測心肌組織CSE表達

　　取大鼠左心室心肌組織，加入預冷RIPA裂解液研磨，提取總蛋白，測定蛋白含量。制備好的蛋白樣品，經12%SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉至PVDF膜，轉膜后置于含5%脫脂奶粉封閉液中封閉2 h，Anti-rabbit CSE/β-actin一抗(CSE 1∶1 000稀釋;β-Actin1∶10 000稀釋)4 ℃下孵育過夜。加HRP標記的Goat-anti-rabbit IgG二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h后，加入ECL發光液顯影，ECL分析系統檢測并拍照，Image J軟件計算條帶吸光度值。

　　2.6 Real-time PCR檢測心肌組織CSE mRNA表達

　　再灌注結束后取大鼠左心室組織，Trizol試劑冰上提取總RNA后，測定樣品RNA純度及濃度。以總RNA為模板，按反轉錄試劑盒合成cDNA，進行擴增。引物序列：CSE-F：CCACCACAACGATTACCC;CSE-R：AGTCCAAACTCGGATGCC，引物長度：112 bp;β-Actin-F：CGTTGACATCCGTAAAGAC;β-Actin-R：TAGGAGCCAGGGCAGTA，引物長度：110 bp。PCR擴增條件為：95 ℃預變性 5 min，95 ℃ 5 s，56 ℃10 s，72 ℃ 25 s循環 40 次。以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算CSE mRNA相對表達量。

　　2.7 統計學處理

　　所有數據以Excel表格進行統計，Graphpad prism 7軟件進行分析。結果以“x±s”表示，組間比較以one-way ANOVA單因素方差分析及q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

　　3 結果

　　3.1 JWDS對MIRI模型大鼠心肌組織超微結構的影響

　　與空白組比較，模型組大鼠心肌組織局部壞死，細胞結構模糊，邊界不清，胞內水腫明顯，心肌細胞走形紊亂。與模型組比較，JWDS組大鼠心肌組織超微結構明顯改善，細胞走形規律，輪廓完整，水腫程度減輕，JWDS+PPG組大鼠心肌組織壞死程度加重，細胞結構破壞，炎性細胞浸潤增多。見圖1。

　　3.2 JWDS對MIRI模型大鼠血清CSE、CK、LDH含量的影響

　　與空白組比較，模型組大鼠血清LDH、CK含量明顯升高(P<0.01)，CSE含量明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，JWDS組LDH、CK含量明顯降低(P<0.01)，CSE含量明顯升高(P<0.01)。與JWDS組比較，JWDS+PPG組CSE含量明顯降低(P<0.01)。

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