摘要：環(huán)狀核苷酸門控通道(CNGC)基因家族是非選擇性陽離子通道基因家族之一，在與植物發(fā)育和環(huán)境脅迫等有關(guān)的生理生化過程中起著至關(guān)重要的作用，但是目前尚無陸地棉CNGC基因家族的全基因組鑒定和分析。基于已知的擬南芥CNGC基因家族成員序列信息，以生物信息學方法分析陸地棉基因組中CNGC家族成員的理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育、染色體定位和差異表達情況。結(jié)果表明，共鑒定出33個GhCNGC基因，它們不均勻地分布在A、D染色體亞組上，其中15個基因分布在A染色體亞組上，18個基因分布在D染色體亞組上。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，GhCNGC基因家族被分為4個主要組，由于在進化過程中不均等地擴增，Ⅳ組又分為Ⅳa和Ⅳb組。同組陸地棉、擬南芥的CNGC基因顯示出相似的保守基序和基因結(jié)構(gòu)，尤其是同源性越近，相似度越高。GhCNGC基因的表達譜以組織特異性模式表達，多數(shù)基因在根、葉中的表達量較高。研究結(jié)果使人們增加了對陸地棉和其他植物中CNGC基因家族的了解。

　　關(guān)鍵詞：CNGC;基因家族;全基因組;陸地棉;染色體定位;差異表達

　　植物中的Ca2+通過鈣離子傳導通道進行信號轉(zhuǎn)導是一種重要的信號轉(zhuǎn)導機制。信號轉(zhuǎn)導有助于植物生長發(fā)育、病原體防御及植物對激素、光和鹽脅迫的反應[1]。環(huán)狀核苷酸門控通道(CNGC)是可滲透Ca2+的陽離子轉(zhuǎn)運通道，調(diào)節(jié)植物生長并應對生物和非生物脅迫。CNGC位于細胞質(zhì)膜或核膜，由Ca2+/鈣調(diào)蛋白(CaM)和環(huán)狀單磷酸核苷酸(cNMPs)等二級信使從細胞內(nèi)部控制[2]。在植物中，CNGC由6個跨膜(TM)域和介于第5、第6個TM域之間的1個孔區(qū)域組成。環(huán)狀核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CNBD)是一個高度保守的區(qū)域，并有1個磷酸鹽結(jié)合盒(PBC)和1個鉸鏈區(qū)。CNGC通過直接結(jié)合環(huán)狀核苷酸而被激活，當鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)合到CaM結(jié)合域時會被抑制[3]。目前，生物信息學工具已在水稻[4]、玉米[5]、擬南芥[6]、甘藍[7]、白菜[8]、番茄[9]中用于識別CNGC基因家族成員。

　　之前的研究發(fā)現(xiàn)，CNGC是植物發(fā)育的關(guān)鍵組成部分。目前，大多數(shù)CNGC已通過遺傳學方法得到表征，并且它們已顯示出與植物生理、分子功能有關(guān)的重要作用，例如信號通路、植物發(fā)育和對環(huán)境脅迫的響應中涉及的多個生理過程。擬南芥環(huán)核苷酸門控通道2(AtCNGC2)參與擬南芥表皮細胞中茉莉酸(JA)誘導的質(zhì)外體Ca2+流入[10]，AtCNGC4可滲透K+、Na+，并被環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)激活[11]，AtCNGC7、AtCNGC8基因?qū)π坌陨沉Φ淖饔弥陵P(guān)重要[12]，AtCNGC16、AtCNGC18基因可參與花粉發(fā)育[13]，AtCNGC6、AtCNGC19、AtCNGC20基因參與了非生物脅迫反應[14]。

　　近年來，人們對植物中的CNGC基因家族進行了研究，然而，關(guān)于陸地棉(Gossypium hirsutum Linn.)CNGC(GhCNGC)基因家族的系統(tǒng)鑒定、起源和功能的研究卻很少。本研究利用陸地棉全基因組序列信息、擬南芥CNGC家族的研究信息及綜合生物信息學分析技術(shù)對陸地棉中CNGC進行全基因組鑒定來完成每個CNGC基因家族成員的深入分析，包括對編碼蛋白的生理、生化特性分析。此外，本研究還分析了CNGC家族成員的表達方式，以闡明其對生物、非生物脅迫響應的機制，并鑒定出可能對育種有用的新基因。

　　1 材料與方法

　　1.1 陸地棉CNGC基因家族成員的篩選鑒定

　　陸地棉TM-1的基因組數(shù)據(jù)來自南京農(nóng)業(yè)大學Cotton Research Institute網(wǎng)站 (http：//mascotton.njau.edu.cn/)，試驗時間為2020年8月，試驗地點為新疆維吾爾自治區(qū)石河子市新疆農(nóng)墾科學院棉花研究所。以擬南芥CNGC基因家族成員的身份標志(ID)為探針在陸地棉TM-1基因組注釋文件中查找陸地棉CNGC家族ID，用虛擬機Bio-Linux 80運行HMM-Search搜索結(jié)構(gòu)域，并提取目標基因序列。

　　1.2 陸地棉CNGC基因家族的理化性質(zhì)分析

　　通過ExPASY-ProtParam在線網(wǎng)站(https：//web.expasy.org/protparam)對陸地棉CNGC蛋白家族氨基酸序列的分子式、總原子數(shù)、親水性平均值、分子質(zhì)量、蛋白不穩(wěn)定系數(shù)等進行預測分析。通過SOPMA在線網(wǎng)站(https：//npsa-prabi.ibcp.fr)分析陸地棉CNGC蛋白家族的二級結(jié)構(gòu)。

　　1.3 陸地棉CNGC基因家族進化樹的構(gòu)建

　　將陸地棉、擬南芥的CNGC蛋白序列以fasta格式保存在1個文件中，用默認參數(shù)運行MEGA 7.0軟件的ClustalW命令，進行序列對齊，采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)進行系統(tǒng)發(fā)育重建，以自舉法(bootstrap method)進行系統(tǒng)發(fā)育計算，引導復制次數(shù)為1 000次，輸出格式為Newick，通過Evolview在線網(wǎng)站進行進化樹的編輯。

　　1.4 陸地棉CNGC基因家族染色體的定位及結(jié)構(gòu)分析

　　根據(jù)陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫中CNGC基因家族成員在染色體上的區(qū)域分布和染色體長度，通過Map Gene 2 Chrom在線網(wǎng)站(http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)繪制染色體分布圖。通過MEME在線網(wǎng)站(http：//meme-suite.org/)進行motif分析，搜索得到motif的總數(shù)為10個。用本地軟件TBtools將CNGC基因家族進化樹、MEME分析圖和基因結(jié)構(gòu)圖進行合并分析。

　　1.5 陸地棉CNGC基因家族的差異表達分析

　　從美國國家生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中下載TM-1標準系陸地棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)包PRJNA248163，以FPKM值作為參數(shù)，將FPKM值低于8的分為一組，高于8的分為另一組。用TB-tools軟件進行基因表達圖譜的繪制。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 陸地棉CNGC基因家族的鑒定分析

　　以已知的20個擬南芥CNGC基因家族成員的蛋白序列作為參考序列，在陸地棉標準系TM-1全基因組數(shù)據(jù)庫中進行比對篩選，最終獲得33個環(huán)狀核苷酸門控通道(CNGC)基因家族成員。由表1可以看出，陸地棉環(huán)狀核苷酸門控通道基因家族成員基因編碼區(qū)(CDS)序列全長為942～3 174 bp，編碼氨基酸313～1 057個，脂肪指數(shù)為77.03～102.46，平均親水性為-0.673～0.097，都屬于親水性蛋白;氨基酸殘基分子量為36.54～121.04 ku，理論等電點為689～9.59。

　　2.2 陸地棉CNGC基因家族的二級結(jié)構(gòu)預測及蛋白的穩(wěn)定性分析

　　由表2可以看出，陸地棉CNGC基因家族成員的二級結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲4種結(jié)構(gòu)組成，并且α-螺旋和無規(guī)卷曲是主要組成部分，所占比例最大。延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角包含的氨基酸殘基數(shù)少，在二級結(jié)構(gòu)中所占比例較小。根據(jù)蛋白不穩(wěn)定指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該家族成員的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為39.11～57.22，僅GhCNGC29為穩(wěn)定蛋白(穩(wěn)定指數(shù)<40)，其余的32個家族成員均為不穩(wěn)定蛋白。

　　2.3 擬南芥與陸地棉CNGC基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

　　本研究從陸地棉標準系TM-1基因組數(shù)據(jù)庫中篩選得到33個GhCNGC基因，根據(jù)這些基因在染色體上的分布情況，將這些基因命名為GhCNGC1～GhCNGC33。依據(jù)擬南芥AtCNGC基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將GhCNGC基因家族的33個成員與AtCNGC基因家族的20個成員的蛋白序列構(gòu)建成系統(tǒng)進化樹。由圖1可以看出，GhCNGC基因家族成員的聚類情況與擬南芥相似，分為4個組群，分別為Group I、Group Ⅱ、Group Ⅲ、Group Ⅳ，其中Group Ⅳ又分為Group Ⅳ a和Group Ⅳ b。Group I含有13個成員，包括7個GhCNGC(GhCNGC1、GhCNGC2、GhCNGC3、GhCNGC4、GhCNGC19、GhCNGC20、GhCNGC21)和6個AtCNGC(AtCNGC1、AtCNGC3、AtCNGC10、AtCNGC11、AtCNGC12、AtCNGC13);Group Ⅱ含有6個GhCNGC(GhCNGC13、GhCNGC14、GhCNGC15、GhCNGC16、GhCNGC17、GhCNGC18)和5個AtCNGC(AtCNGC5、AtCNGC6、AtCNGC7、AtCNGC8、AtCNGC9);Group Ⅲ含有10個GhCNGC (GhCNGC22、GhCNGC23、GhCNGC24、GhCNGC25、GhCNGC26、GhCNGC27、GhCNGC28、 GhCNGC29、 GhCNGC30、GhCNGC31)和5個AtCNGC(AtCNGC14、AtCNGC15、AtCNGC16、AtCNGC17、AtCNGC18);Group Ⅳa含有2個GhCNGC(GhCNGC32、GhCNGC33)和2個AtCNGC(AtCNGC19、AtCNGC20);Group Ⅳb含有8個GhCNGC(GhCNGC5、GhCNGC6、GhCNGC7、GhCNGC8、GhCNGC9、GhCNGC10、GhCNGC11、GhCNGC12)和2個AtCNGC(AtCNGC2、AtCNGC4)。

　　2.4 陸地棉CNGC家族成員的染色體定位

　　根據(jù)陸地棉標準系TM-1的基因組數(shù)據(jù)庫資源，通過網(wǎng)站MapGene2Chrom進行在線GhCNGC家族成員的染色體定位分析[15]。將GhCNGC家族的33個成員定位在19條染色體上，并繪制該家族的基因圖譜。結(jié)果(圖2)顯示，分布在D基因組亞組的基因最多，有18個，而這18個基因主要分布在染色體的兩端，分布在上端的基因比分布在下端的基因多，分布在中間部位的基因僅有3個。分布在A基因組亞組的基因相對較少，有15個，這15個基因依然主要分布在染色體的兩端。分布在D04、D05、D09和A05染色體上的基因最多，分別為3、3、3、6個，而其他染色體上僅分布1～2個該家族基因成員。

　　2.5 陸地棉CNGC的系統(tǒng)進化和基因結(jié)構(gòu)分析

　　通過MEME在線網(wǎng)站[16]及TB-tools軟件[17]分析GhCNGC家族成員的保守基序、內(nèi)含子和外顯子的數(shù)量及分布。由圖3可以看出，同一亞家族成員分布在同一進化分支上，與圖1中的進化分析結(jié)果相同。分析motif的數(shù)量及位置發(fā)現(xiàn)，同一組成員的motif數(shù)量基本相同，且分布的位置較接近，在不同組之間存在差異。該家族33個成員中的24個成員均含有10個motif，8個成員的motif數(shù)量為9個，1個成員的motif數(shù)量為5個。而motif數(shù)量為9個的成員大多分布在Ⅳ組，可能由于Ⅳ組與其他3組的親緣關(guān)系較遠。有趣的是，Ⅱ組中的GhCNGC16僅有5個motif基序。從在內(nèi)含子與外顯子的分布情況看出，多數(shù)同一組成員的內(nèi)含子及外顯子數(shù)量較為接近，I組7個成員外顯子數(shù)為6～8個;Ⅱ組6個成員的外顯子數(shù)量為3～7個，除GhCNGC之外，均為7個外顯子;Ⅲ組的外顯子數(shù)量為5～11個;Ⅳ組的外顯子數(shù)量為7～13個， 但是Ⅳ a的2個成員的外顯子數(shù)量分別為12、13個，Ⅳ b的成員中，5個外顯子數(shù)量為7個，3個外顯子數(shù)量為8個。而且同一組成員的外顯子、內(nèi)含子分布情況類似，差異顯著性小，表明了進化的保守性。不同組之間的差異較為顯著，尤其是Ⅳ組的成員之間及其與其他組相比較差異較大。