摘要：【目的】探討在巰乙基磺酸鈉(MESNa)與碳酸氫銨(NH4HCO3)存在下，對在大腸桿菌上表達的重組融合蛋白中內(nèi)含肽(Intein)用硫醇(DTT)進行自剪切，促使抗菌肽(MME)碳末端實現(xiàn)酰胺化。【方法】構(gòu)建用大腸桿菌表達內(nèi)含肽介導的MME重組質(zhì)粒，通過表達獲得依次由“組氨酸、Sumo標簽、MME、內(nèi)含肽”構(gòu)成的融合蛋白，用鎳柱及透析進行純化，在MESNa和NH4HC03存在下，用DTT對內(nèi)含肽進行白剪切，促使MME碳末端酰胺化，腸激酶切割、純化，得到碳末端酰胺化的MME。質(zhì)譜和二級串聯(lián)質(zhì)譜配合使用，檢測MME及其碳末端酰胺化。【結(jié)果】通過PCR，鑒定融合蛋白，其基因片段為837bp，符合預期。質(zhì)譜鑒定得MME相對分子量為3057.7與其理論值3057.64一致。二級串聯(lián)質(zhì)譜檢測得MME碳端碎片的分子量為1214.728，與碳末端酰胺化的MME碳端碎片理論分子量1214.739相符，匹配度為45，表明本研究制備的MME碳末端已被酰胺化，該蛋白為可溶。【結(jié)論】用大腸桿菌成功地表達了重組融合蛋白，在MESNa與NH4HCO3存在下，促進了內(nèi)含肽白剪切，MME碳末端被酰胺化，實現(xiàn)了簡單的“一步法”制備。質(zhì)譜與二級串聯(lián)質(zhì)譜配合使用，可靈敏、簡單地對碳末端酰胺化多肽進行檢測，可作為該項檢測方法的一種選擇，結(jié)果表明，本研究成功地制備了碳末端酰胺化的MME。

　　關鍵詞：抗菌肽;酰胺化;內(nèi)含肽介導;自剪切

　　0引言

　　【研究意義】抗生素過度使用出現(xiàn)的食品藥殘和細菌耐藥性問題[1]，使畜禽飼養(yǎng)中抗菌問題遇到了極大麻煩。抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPS)抗菌譜廣，細菌不大可能對其耐藥[2]。但要使AMPS產(chǎn)業(yè)化，主要還面臨著要提高其活性[3]和半衰期，降低其毒性和生產(chǎn)成本。本課題組設計并化學合成了抗菌能力強、半衰期長、毒性低的碳末端酰胺化的抗菌肽(MME)，其氨基酸序列為：GRGDSPKFLHSAKKFGKAFPAVLKVLTTG[4]。本研究探討通過基因工程表達法，生產(chǎn)目標抗菌肽MME以期降低生產(chǎn)成本。

　　【前人研究進展】獲得AMPS方法有3種：從生物體中提取、化學法合成和基因工程表達，其中第三種方法成本最低[5]。基因工程表達系統(tǒng)有多種，其中大腸桿菌(E.coli)表達系統(tǒng)優(yōu)勢明顯，因此被廣泛采用[6]。碳末端酰胺化的AMPS在人體內(nèi)有重要的生理功能，其碳端末端的α-酰胺基對AMPS的活性起著很重要作用，有些AMPS在酰胺化前后的生物活性相差可達萬倍[7];其還可起保護作用，減弱蛋白酶對AMPS的降解，延長AMPS的半衰期[8]。可是大腸桿菌直接表達的多肽產(chǎn)物碳末端均為羥基。為此，研究者提出先用基因工程手段表達碳末端為羥基的多肽，然后再進行第二步的酰胺化修飾，最終獲得碳末端酰胺化的目標多肽。如：重組表達α-酰胺化酶在體外進行多肽C端酰胺化，用溴化氰裂解融合表達產(chǎn)物所得的鮭魚降鈣素的體外酰胺化加工。

　　但這些工藝都存在一些不足，前者在酰胺化過程中需提供酰胺化工具酶，制備中純化步驟多，技術(shù)要求較高，成本較大[9];后者在酰胺化過程中要使用溴化氰[10]，會對環(huán)境造成污染，制約了他們的大規(guī)模生產(chǎn)。現(xiàn)在研究者仍投入大量精力，以期開發(fā)出更完善的工藝[7]。存在于前體蛋白結(jié)構(gòu)中的內(nèi)含肽(Intein)序列，能從前體蛋白中白我剪切，還能將剪切下的兩側(cè)肽鏈連成肽鍵。Li Yifeng[11]對內(nèi)含肽的生物應用做了較全面的介紹，周冠、俞超等[7，12]用內(nèi)含肽介導表達天蠶素多肽，僅用硫醇DTT對表達的融合蛋白中含有的內(nèi)含肽進行自剪切，同時使融合蛋白中含有的抗菌肽碳末端實現(xiàn)酰胺化。Stevens A J[13]在用DTT使內(nèi)含肽自剪切時，加入了NH4HC03，以利于多肽碳末端的酰胺化。對碳末端酰胺化的抗菌肽的檢測，也是困擾研究者的又一大問題[14]。

　　【本研究切人點】前人研究表明，用大腸桿菌表達系統(tǒng)，最終要獲得碳末端酰胺化的AMPS還存在不少困難，主要問題是促進表達產(chǎn)物碳末端的酰胺化。通過酰胺化酶對大腸桿菌表達所得前體蛋白進行酰胺化與用化學合成制備法比較，雖可簡化純化工藝[14]，但需二步法制備[7]，過程仍較復雜;用內(nèi)含肽介導在大腸桿菌上表達含MME的融合蛋白，通過DTT實現(xiàn)內(nèi)含肽白剪切，雖可實現(xiàn)一步法制備碳末端酰胺化多肽，但酰胺化過程困難[7，12]。本研究探討在上述酰胺化體系中，引入巰乙基磺酸鈉(MESNa)和碳酸氫銨(NH4HCO3)，促進MME碳末端酰胺化的進行;將質(zhì)譜和二級串聯(lián)質(zhì)譜配合使用，鑒定MME，并檢測其碳末端酰胺基的存在。【擬解決的關鍵問題】本研究探討在MESNa和NH4HCO3存在下，用DTT對內(nèi)含肽進行白剪切，促進多肽碳末端酰胺化;將質(zhì)譜與二級串聯(lián)質(zhì)譜配合使用，希望能探索一種靈敏、簡單地檢測AMPS碳末端酰胺化的方法，促進對多肽碳末端酰胺化的研究。

　　1材料與方法

　　1.1主要試劑、儀器及材料

　　1.1.1主要試劑與儀器 質(zhì)粒抽提、凝膠回收試劑盒(天根生物公司)，NdeI、XhoI和腸激酶(EK)[TaKara(大連)公司]，蛋白maker[TaKara(大連)公司]，大腸桿菌BL21(DE3)(本室保存)，PET30a(本室保存)，6×His標簽抗體(上海生工)，IPTG、硫醇(DTT)(Solarbio)，Ni-NTA beads 6FF(天地人和公司)，其余試劑為國產(chǎn)分析純，電泳系統(tǒng)、成像系統(tǒng)(Tahon)，半干電轉(zhuǎn)儀(Tahon)，紫外可見分光光度計(日本HITACHI)，高效液相-電噴霧質(zhì)譜( Aglient)。

　　1.1.2主要溶液配制 緩沖溶液Buffer簡記：Buf，Buf A中DTT濃度為1mmol·L-1，Buf(B、C、D)中咪唑濃度分別為20mmol·L-1、40mmol·L-1和500mmol·L-1，上述緩沖液的NaCI、Na3PO4濃度分別為500mmol·L-1和25mmol·L-1， pH=7.5;Buf(E、F、G、H)中咪唑濃度分別為0、20mmol·L-1、40mmol·L-1、250mmol·L-1，上述緩沖液中的Tris、NaCl、甘油的濃度分別為20mmol·L-1、300mmol·L-1和10%，pH=8.0。

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