摘要：農桿菌(Agrobacterium)是生活在植物根的表面依靠由根組織滲透出來的營養物質生存的一類普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性細菌。農桿菌介導法 是模仿農桿菌都植物的進化誘導

　　1虎杖莖尖對潮霉素的敏感性

　　本研究以潮霉素作為篩選標記,為有效篩選抗性苗,將制備的莖尖分別置于不同濃度梯度的潮霉素培養基上進行篩選,觀察外植體的色澤變化、生長狀態和存活情況,試驗結果見表1和圖1。從表1和圖1結果可以看出,對照組的虎杖莖尖生長迅速,并分化出綠色的芽,芽的存活率為95.6%;隨著潮霉素濃度的增高外植體生長減緩,分化出的芽弱小且存活率逐漸降低至23.7%;高濃度潮霉素處理造成植物組織失綠褐化并迅速死亡。當潮霉素濃度在4mg/L以下不能有效抑制非轉化細胞的生長,容易造成大量非轉化體的逃逸;潮霉素濃度在15mg/L以上時,外植體迅速死亡將影響轉化細胞的正常生長;而潮霉素濃度8mg/L處理既能有效抑制非轉化組織的生長,又不至于造成細胞迅速死亡,所以潮霉素濃度8mg/L是莖尖轉化外植體篩選的適宜濃度。

　　2預培養時間對轉化的影響

　　將虎杖莖尖分別預培養1、2、4和8d,侵染菌液濃度OD600值約0.4,侵染莖尖10min,共培養3d,統計轉化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數見表2。結果表明,適當的預培養可以提高莖尖的再生分化率。預培養1d時的再生分化率較低(2.3%),再生芽生長細弱,不利于潮霉素抗性苗的獲得;預培養2d的莖尖再生分化率最高(4.7%),再生芽生長健壯;預培養8d時的再生分化率反而下降(2.4%)。所以選擇2d作為預培養的時間。

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　　3菌液濃度對虎杖遺傳轉化的影響

　　將農桿菌的濃度OD600稀釋為0.2、0.4、0.6和0.8,侵染預培養2d的莖尖10min,共培養3d,以轉化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數作為評價指標(表3)。本研究中不同的菌液侵染濃度對侵染效果的影響顯著。菌液侵染濃度OD600在0.2時分化率只有2.4%,濃度為0.6時的分化率達5.5%,之后隨著濃度的增高分化率降低。故將農桿菌菌液濃度稀釋至0.6進行侵染。

　　4侵染時間對虎杖遺傳轉化的影響

　　分別侵染預培養2d的莖尖5、10、15、20和25min,菌液濃度OD600約0.6,共培養3d,以轉化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數作為評價指標(表4)。經10min侵染后的分化率與其他侵染處理都有顯著差異,侵染5、20和25min之間的差異不顯著。侵染10min的再生分化率達5.3%,增殖系數較高且再生芽強壯,故將侵染時間選擇在10min。

　　5共培養時間對虎杖遺傳轉化的影響

　　用OD600值約0.6的菌液侵染預培養2d的莖尖10min,分別于黑暗中共培養2、3、4和5d,以轉化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數作為評價指標(表5)。不同共培養時間對侵染結果的影響差異較大,2d時分化率較低(2.4%),經3d共培養后分化率可達5.6%,但是共培養5d后的分化率又降到2.9%。本試驗條件下選擇在侵染后共培養3d較為適宜,有利于獲得較多生長健壯的抗性再生芽。

　　6虎杖轉化苗的獲得

　　虎杖莖尖遺傳轉化各階段如圖2所示。剝離好的莖尖經預培養后(圖2-A),進行農桿菌侵染,并共培養3d(圖2-B);然后轉移到篩選培養基上篩選(圖2-C),不具潮霉素抗性的莖尖逐漸褐化死亡;將經篩選后成活的莖尖轉移到增殖培養基上(圖2-D),促進芽增殖與伸長;待幼苗生長至3-5cm高,轉至根誘導培養基進行生根(圖2-E);最后移栽到盆土中生長(圖2-F)。

　　7轉基因虎杖的PCR檢測

　　按照上述遺傳轉化體系,剝取虎杖莖尖300個,經農桿菌侵染轉化、篩選,獲得了移栽成活的抗性植株共15株,潮霉素基因的PCR檢測(圖3)顯示其中6株為轉基因的陽性植株,這些轉基因植株均含有預期的約500bp的DNA片段。

　　8轉基因虎杖的Southern雜交

　　選取PCR鑒定為陽性的轉基因虎杖植株,提取葉片基因組DNA,經EcoRI酶切、電泳、轉膜后以潮霉素基因為雜交探針的Southern雜交結果(圖4)表明,在這6個株系中均檢測到雜交條帶,而野生虎杖沒有雜交信號。因此,這些轉基因虎杖株系的基因組中確實整合了目的基因。

　　9討論

　　本試驗前期采用葉盤法和愈傷組織侵染方法進行轉化遇到諸多困難:葉盤經過不同激素組合誘導,較難誘導產生不定芽;虎杖是含酚類物質較高的藥用植物,其愈傷組織易褐化、難分化成苗。而植物莖尖具有變異性小、有利于保持原有材料的優良性狀等特點,國內外很多學者利用莖尖或莖尖分生組織獲得了轉基因植株[9-13]。因此,本試驗選擇莖尖為轉化受體,探討了影響虎杖莖尖遺傳轉化的主要因素。潮霉素的毒性機理是干擾植物細胞葉綠體和線粒體中的核糖體與延長因子EF-2的結合,從而抑制肽鏈的延長。潮霉素濃度過低易造成假陽性率過高;潮霉素濃度過高,可能導致不能得到足量的轉基因植株。在對植物材料進行基因轉化之前,對受體材料進行潮霉素敏感性試驗是十分必要的。段曉昱等[15]的研究表明向日葵莖尖、子葉、胚軸不同部位轉化外植體對潮霉素敏感性存在一定的差異;大豆品種黑農35的子葉節分化的潮霉素篩選濃度為6mg/L,而叢生芽生根的潮霉素篩選濃度降低為2mg/L[16];可見對于同一種植物,不同的外植體對抗生素的敏感性也是不同的。本研究通過虎杖莖尖對潮霉素的敏感性試驗,確定了虎杖莖尖轉化的適宜濃度為8mg/L。在連續篩選過程中一直使用同一濃度進行篩選,這可能是造成轉化率低的原因之一。在后續的研究中可以考察虎杖不同部位外植體對潮霉素的敏感性,采用梯度添加篩選劑的方式來提高轉化率。在植物遺傳轉化中,預培養可以促進細胞分裂,處于分裂狀態的細胞更易整合外源DNA,從而提高轉化率;另一方面預培養能減少褐化現象的產生[17]。趙福永[18]對含酚類物質較高的棉花進行了預培養處理,根誘導階段根誘導率要比對照組高15%左右。虎杖也是含酚類物質較高的植物,本試驗中預培養2d是最佳處理,而預培養時間超過8d,轉化率顯著下降。轉化率隨著預培養時間的延長先增加后下降,在高粱莖尖轉化中也有類似報道,其原因可能是預培養時間過短莖尖傷口未愈合易受農桿菌的侵害;預培養時間過長莖尖傷口細胞已不能提供足夠的誘導農桿菌貼壁的受體,或由于莖尖分生組織細胞的分裂速度減緩,進入細胞核的T-DNA量減少[13]。王沛雅等[19]對河北楊的遺傳轉化研究表明,預培養2d以上可以顯著提高轉化率,但預培養2-8d間的差異不顯著,轉化率并不表現出隨著預培養時間的延長先增加后下降的趨勢,說明預培養的時間對轉化率的影響可能與所選用植物材料等有關系。本試驗成功建立了虎杖莖尖為轉化受體、以潮霉素為篩選劑的根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系,但虎杖莖尖的轉化率遠低于棉花[20]、小麥[9]等作物的莖尖轉化效率,所以該遺傳轉化體系還有待優化。后續工作可以從農桿菌菌株、農桿菌介導法結合漩渦振蕩、真空負壓處理等方面來進一步優化該轉化體系。本試驗希望通過提高關鍵酶基因PcRS在虎杖中的表達水平,調控虎杖中白藜蘆醇的生物合成。PCR和Southern雜交檢測,表明外源基因已經整合到轉基因植株的基因組中。但是本試驗只進行EcoRI酶的單酶切,還不能準確確認外源基因插入的拷貝數和位點。在后續Southern雜交試驗中可以采用多個限制性內切酶進行單酶切,或者采用雙酶切。另外轉基因植株的遺傳穩定性、外源基因的表達、活性成分的含量變化等方面還需要進一步深入研究。

　　10結論

　　采用根癌農桿菌EHA105菌株侵染虎杖莖尖較適宜的轉化系統為:預培養2d,農桿菌菌液濃度OD600為0.6,侵染10min,共培養3d,在篩選培養基中添加8mg/L潮霉素,待篩選獲得的抗性芽生長至3-5cm高,再轉至根誘導培養基使其長成完整植株。利用該體系成功實現虎杖莖尖遺傳轉化白藜蘆醇合酶基因,本研究結果為拓寬虎杖遺傳轉化受體提供了技術和方法。