摘 要：由植原體引起的檳榔黃化病是海南特色經(jīng)濟作物檳榔種植上的一種毀滅性病害。本研究通過PCR擴增測序、序列多重比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，對海南部分代表性地區(qū)檳榔致死性病原植原體的序列信息與系統(tǒng)發(fā)育關系進行檢測分析。結果表明：本研究檢測的保亭、屯昌、萬寧等海南部分代表性地區(qū)的檳榔黃化植原體的16S rDNA序列一致;BLAST分析表明各株系16S rDNA與16SrI組植原體同源性為100%。序列多重比對分析表明，本研究各檳榔黃化植原體株系與海南苦棟叢枝、長春花綠變、馬松子變?nèi)~、辣椒黃化皺縮、蛇婆子叢枝、細圓藤叢枝和日本洋蔥黃化、美國翠菊黃化等植原體同源性為100%;與已報道的海南萬寧、印度、海南三亞的檳榔黃化植原體16S rDNA序列同源性分別為99.9%、99.9%、99.8%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，本研究檳榔黃化植原體與海南苦棟叢枝、長春花綠變、馬松子變?nèi)~、辣椒黃化皺縮、蛇婆子叢枝、細圓藤叢枝等株系聚于一個分枝，支持率為100%。此外，在發(fā)病檳榔葉片、花穗、心葉等組織部位均可檢測到植原體。研究結果表明，海南檳榔黃化植原體與海南苦棟叢枝、長春花綠變、馬松子變?nèi)~、辣椒黃化皺縮、蛇婆子叢枝、細圓藤叢枝等植原體株系的同源性極高，檳榔黃化病很可能會以這些寄主植物作為病原傳播載體進行傳播擴散。

　　關鍵詞：植原體;檳榔黃化病;分子檢測;親緣關系;傳播載體

　　植原體(phytoplasma)是一類寄生于植物韌皮部通過刺吸式口器昆蟲傳播的植物毀滅性病原菌，1967年由日本學者土居養(yǎng)二首次發(fā)現(xiàn)[1]。植原體很難從植物或昆蟲寄主中分離純化培養(yǎng)，對其遺傳信息及表達代謝等了解相對不足，嚴重制約植原體研究[2-3]。植原體引起的病害寄主種類多、分布范圍廣、危害程度大，對社會經(jīng)濟、生態(tài)環(huán)境等影響嚴重，該病害目前尚無有效的治療藥劑，以防為主。海南省植原體病害種類十分豐富，約占我國已鑒定植原體病害的五分之一，海南植原體病害遍及整個海南島且危害程度嚴重，給海南省農(nóng)林業(yè)造成巨大損失[4]。海南省受植原體病害影響的作物有檳榔(Areca catechu L.)、花生(Arachis hypogaea)、苦楝(Melia azedarach)、長春花(Catharanthus roseus)、辣椒(Capsicum annuum)、細圓藤(Pericampylus glaucus)、山黃麻(Trema tomentosa)等海南特色經(jīng)濟作物或綠化植物，對海南的社會經(jīng)濟和生態(tài)環(huán)境等造成嚴重的影響[4-8]，其中檳榔黃化病(areca palm yellow leaf disease， AYL)在海南發(fā)生普遍且嚴重，影響巨大。

　　檳榔是我國“四大南藥”之首和海南省重要特色經(jīng)濟作物，具有很高的藥用價值和經(jīng)濟價值。由植原體引起的檳榔黃化病是海南檳榔種植上的一種毀滅性病害，對海南的社會經(jīng)濟和生態(tài)環(huán)境造成嚴重影響。海南檳榔黃化病于1981年首次發(fā)現(xiàn)于屯昌縣，目前已由發(fā)病初期的屯昌縣蔓延至海口、文昌、瓊海、萬寧、陵水、瓊中、定安、樂東、保亭、三亞、五指山等多個市(縣)[4， 9]。金開璇等[10]通過超薄電鏡切片在檳榔黃化病染病組織中觀察到了植原體。車海彥[4]、羅大全等[11]、通過超薄電鏡切片觀察、四環(huán)素注射處理、PCR擴增檢測等技術進一步證實植原體是海南檳榔黃化病的病原。近年來，在海南不同檳榔種植區(qū)均有不同程度的發(fā)生，且發(fā)病地區(qū)及面積仍在不斷擴大，嚴重影響海南檳榔產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[4， 9]。目前，海南植原體病害的發(fā)生傳播、擴散流行等問題尚不清楚，海南不同縣(市)、不同生境、不同發(fā)病區(qū)植原體的來源、傳播途徑等問題尚不明確，這些問題嚴重制約海南相關植原體病害的防控管理。

　　本研究對海南不同代表性地區(qū)的檳榔黃化病進行調(diào)查，采集檳榔黃化病及疑似植原體引起的其他植物病害樣品，通過PCR擴增檢測、序列多重比對、系統(tǒng)發(fā)育分析等技術方法，從分子水平上對海南檳榔黃化植原體進行檢測鑒定，豐富對檳榔黃化植原體分子水平上的認知。對本研究中檳榔黃化植原體與前期已報道的檳榔黃化植原體及親緣關系或地理分布密切相關的植原體株系間的系統(tǒng)發(fā)育關系進行分析，揭示不同寄主植原體株系間遺傳變異水平和系統(tǒng)發(fā)育關系。為檳榔黃化病在海南的傳播擴散、流行監(jiān)測和科學防控等研究提供科學參考，以促進海南該類病害防控理念的發(fā)展與提升。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 樣品采集 實驗材料于2019—2020年采自海南保亭、屯昌、萬寧等地疑似檳榔黃化植原體引起的檳榔黃化病植株，每個地點采集3份葉片樣品;針對同一株發(fā)病檳榔，采集葉片、花穗、心葉、莖皮、根等不同組織部位，每個組織部位采集3份樣品，同時采集健康的檳榔樣品作為對照，用作陽性對照的泡桐叢枝植原體樣品取自中國林業(yè)科學研究院，所采樣品低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.1.2 試劑 植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、2×PCR Master Mix預混液、50×TAE、SYBR Green I染料、6×Loading Buffer、DNA分子量標準DL2000購自天根生化科技(北京)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR擴增引物由生工生物(上海)工程股份有限公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 總DNA提取 葉片、花穗、心葉、莖皮、根等樣品取樣量均為0.1 g，利用CTAB法提取染病檳榔組織中的總DNA，植原體總DNA提取方法參考天根植物基因組DNA提取試劑盒說明書方法。

　　1.2.2 PCR擴增測序 檳榔黃化植原體通過植原體通用引物R16mF2/R16mR1、R16F2n/R16R2[2]進行擴增。用引物R16mF2/R16mR1擴增的PCR產(chǎn)物稀釋50倍后用作引物R16F2n/R16R2進行巢式PCR擴增的模板，引物序列信息見表1。PCR反應體系和條件如下：PCR反應體系為25 μL，包括1.0 μL DNA模板，1.0 μL上游引物和下游引物(10 μmol/L)，12.5 μL 2×PCR Master Mix(包含0.05 U/μL Taq DNA聚合酶，4 mmol/L MgCl2和0.4 mmol/L dNTPs)，用ddH2O補至25 μL。反應條件為94.0 ℃，5 min;94.0 ℃，30 s，53.0 ℃，40 s，72.0 ℃，1 min 30 s(直接PCR)或1 min 20 s(巢式PCR)，共35個循環(huán);72.0 ℃，10 min。PCR擴增產(chǎn)物用SYBR Green I染色、經(jīng)1.0%(w/V)瓊脂糖凝膠、凝膠成像系統(tǒng)檢測。相關PCR擴增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠檢測，有明顯目的條帶的擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。本研究所得核苷酸序列均上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫。