摘要 [目的]研究碳點(diǎn)(CDs)對作物種子萌發(fā)及生長的影響。[方法]采用微宇宙培養(yǎng)系統(tǒng)，探究10 mg/L下CDs處理對菠菜(伏播611)種子發(fā)芽性能及幼苗生長的影響。[結(jié)果]在菠菜種子培植10 d后，CDs處理的菠菜種子萌發(fā)率為69.0%，顯著高于對照組(46.0%，P<0.05)。CDs增加了菠菜幼苗的生物量，相對于對照組，鮮重提高30.1%，干重提高55.3%。CDs上調(diào)了菠菜種子的水通道蛋白基因表達(dá)，增加對水分的吸收，促進(jìn)菠菜種子萌發(fā)及生長。[結(jié)論]CDs可以作為一種優(yōu)良的納米材料應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中，特別是應(yīng)用在作物種子的萌發(fā)及生長方面。

　　關(guān)鍵詞 碳點(diǎn);菠菜種子;萌發(fā);幼苗生長;水通道蛋白基因

　　我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，長期面臨著人多地少、資源短缺、糧食不足的壓力。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過多依賴資源消耗，農(nóng)業(yè)環(huán)境污染問題日益突出。因此，如何探索出一條高效、安全、資源節(jié)約、環(huán)境友好的可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展道路，是當(dāng)前必須應(yīng)對的重大挑戰(zhàn)。近年來，以人工納米材料(engineered nanomaterials，ENMs)生產(chǎn)的納米化肥、納米農(nóng)藥、納米農(nóng)業(yè)傳感器等新穎納米農(nóng)業(yè)產(chǎn)品，在提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)、降低資源投入、減少農(nóng)業(yè)環(huán)境污染等方面已經(jīng)顯現(xiàn)出巨大潛力[1-3]。已有研究表明，250 mg/kg CeO2 ENMs 在土壤中能夠抑制番茄鐮刀菌的生長，比對照組降低53%[4];100 mg/L CuO ENMs能夠提高水稻產(chǎn)量25%[5];500 mg/kg TiO2 ENMs 能夠增加麥粒中所有氨基酸的含量，而同等濃度下Fe2O3 ENMs只能增加半胱氨酸和酪氨酸的含量[6];0.8 mg/L Fe3O4 ENMs能夠促進(jìn)草莓組培苗的生長并提高其對干旱脅迫的抗性[7];水培條件下50 mg/L的γ-Fe2O3 ENMs分別提高柚子幼苗葉綠素含量和根系活力23.2%和23.8%[8]。盡管這些金屬或金屬氧化物的ENMs可以有效調(diào)控作物產(chǎn)量及品質(zhì)，但農(nóng)業(yè)中的不當(dāng)使用或過度使用仍會(huì)損害生態(tài)系統(tǒng)并造成實(shí)質(zhì)性問題。

　　碳點(diǎn)(carbon dots，CDs)作為一類新興的碳基熒光ENMs，由于其表現(xiàn)出的優(yōu)良性能，如光吸收較寬、熒光可調(diào)、發(fā)光效率高、抗光漂白、化學(xué)穩(wěn)定性高、生物相容性好、低毒性等，被廣泛應(yīng)用于生物成像、藥物遞送、催化、光電器件等領(lǐng)域[9]。近年來，CDs被證實(shí)能夠促進(jìn)作物生長，改善植物的光合作用，增強(qiáng)植物的抗性及固氮能力[10-11]。例如，0.02 mg/L 的CDs可以提高綠豆芽鮮重14.9%，促進(jìn)光合產(chǎn)物碳水化合物的合成(21.9%)[10];0.1和100.0 mg/kg的碳黑材料可以增強(qiáng)大豆固氮作用(91%以上)[11]。前期研究表明石墨烯類ENMs具有豐富的含氧官能團(tuán)，能夠增加水分的輸送，促進(jìn)種子萌發(fā)[12]。

　　種子的萌發(fā)在植物生長周期過程中屬于一個(gè)極為關(guān)鍵的時(shí)期，也是對非生物環(huán)境因子極為敏感的階段。植物幼苗能否迅速健壯的生長與種子萌發(fā)能力密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，CDs在種子發(fā)芽階段發(fā)揮著重要的作用。CDs(0.56 mg/mL)顯著促進(jìn)水稻種子的萌發(fā)[13];25%的CDs溶液可以在5 d時(shí)促進(jìn)綠豆種子發(fā)芽[14]。然而CDs促進(jìn)種子萌發(fā)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。菠菜(Spinacia oleracea L.)富含豐富的胡蘿卜素、維生素C、氨基酸以及Fe、P、Na、K等礦質(zhì)元素，是我國食用的重要綠葉蔬菜之一[15]。因此，該研究選取菠菜作為供試作物，揭示CDs促進(jìn)種子萌發(fā)及生長的機(jī)制，以期為CDs在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗(yàn)材料 該試驗(yàn)于江南大學(xué)環(huán)境過程與污染控制研究所進(jìn)行。供試菠菜種子(伏播611)購于河北大禹種業(yè)有限公司。CDs合成原料檸檬酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，尿素購自上海泰坦科技股份有限公司。試驗(yàn)所用去離子水為實(shí)驗(yàn)室自制。試驗(yàn)用土為潮土，土壤基本理化性質(zhì)為pH 7.5、有機(jī)質(zhì)20 mg/kg。

　　該試驗(yàn)所用CDs為自制：取檸檬酸1.0 g和尿素0.5 g，溶解于40 mL純水中，裝入50 mL高壓反應(yīng)釜中，在180 ℃的烘箱中反應(yīng)10 h后，經(jīng)過濾，收集溶液，隨后將所收集的溶液通過真空冷凍干燥機(jī)(中國上海比朗FD-1A-50)干燥得到樣品[16]。

　　1.2 試驗(yàn)方法

　　1.2.1 CDs懸浮液的制備。

　　從制備的CDs樣品中稱取一定量加入純水中，將溶液在20 ℃下利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(新芝SCIENTZ-IID)進(jìn)行超聲處理(200 W，20 kHz)10 min，使其均勻分散于水中形成納米材料懸浮液，最終制備出濃度為10 mg/L 的CDs懸浮液。

　　1.2.2 CDs性質(zhì)的表征。

　　通過透射式電子顯微鏡(TEM，日本電子株式會(huì)社JEM-2100)觀察CDs形態(tài)與粒徑分布，利用X射線光電子能譜(XPS，美國賽默飛ESCALAB 250Xi)和傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀(FTIR，德國布魯克TENSOR 27)測定CDs表面的主要官能團(tuán)種類及其元素組成。

　　1.2.3 菠菜發(fā)芽試驗(yàn)。

　　選取直徑5 cm、鋪有1層定性濾紙的塑料培養(yǎng)皿，挑選大小均勻飽滿的42粒菠菜種子(伏播611)，用0.05%的次氯酸鈉溶液浸泡 30 min 以除去表面細(xì)菌，再用去離子水多次沖洗后培育于培養(yǎng)皿，均勻排布。將純水和處理濃度為10 mg/L的CDs溶液分別噴施于培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿用封口膜密封后于25 ℃下避光培養(yǎng)。

　　選取長54 cm、寬28 cm，共50穴的育苗穴盤，其中12個(gè)穴位鋪滿土壤。試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)處理，分別為空白(CK)以及2個(gè)碳點(diǎn)(CDs1和CDs2)處理，每個(gè)處理4個(gè)穴位，挑選大小均勻的108粒菠菜種子(伏播611)，用0.05%的次氯酸鈉溶液浸泡 30 min 以除去表面細(xì)菌，再用去離子水多次沖洗后培育于育苗穴盤中，每個(gè)穴位播種9粒種子，均勻排布。將純水和處理濃度為10 mg/L的CDs1和CDs2溶液分別噴施于育苗穴盤中，將育苗穴盤放于25 ℃下避光培養(yǎng)。

　　1.3 測定方法

　　1.3.1 發(fā)芽率。試驗(yàn)測試期間每日記錄菠菜種子的發(fā)芽數(shù)，試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算菠菜種子的發(fā)芽率，計(jì)算公式為：發(fā)芽率=(發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))× 100%。

　　在試驗(yàn)測試期間種子幼根或子葉伸出種皮視為萌發(fā)，只有幼根超過1 mm才被記為根長。

　　1.3.2 生物量。

　　在發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，收集菠菜幼苗，利用電子天平測定其鮮重，通過烘箱干燥后，測定其干重。

　　1.3.3 根參數(shù)。

　　在發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，收集菠菜幼苗，利用掃描儀(Scanner，日本愛普生12000XL)測定菠菜幼苗的長度和表面積。

　　1.3.4 水通道蛋白表達(dá)量測定。

　　選定2條PIPs基因特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR分析[17]。在對菠菜進(jìn)行發(fā)芽處理5 d以后，用液氮快速冷凍菠菜幼苗，并仔細(xì)研磨至呈粉末。采用通用植物總RNA提取試劑盒(Takara，Japan)提取菠菜幼苗的總RNA。提取的RNA用超微量分光光度計(jì)測定樣品的純度和濃度，檢驗(yàn)合格的RNA進(jìn)行后續(xù)反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。隨

　　后用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，Japan)將符合要求的RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.4 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)均采用OriginPro 2016 SR0程序進(jìn)行分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)對空白和處理組的平均值進(jìn)行比較，分析結(jié)果進(jìn)行Tukey-Kramer檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 CDs ENMs的表征

　　試驗(yàn)用的CDs ENMs采用一步水熱法制備[16]，其結(jié)構(gòu)、尺寸、表面化學(xué)性質(zhì)由電子透射顯微鏡(TEM)、傅立葉轉(zhuǎn)換紅外線光譜(FTIR)和X射線光電子能譜(XPS)進(jìn)行表征。從TEM照片(圖1)可以看出，CDs尺寸分布均在10 nm以下，平均尺寸為(5.5±0.3)nm，呈規(guī)則圓形顆粒狀。FTIR結(jié)果證實(shí)CDs的主要官能團(tuán)包括—OH、CO、CC

　　等(圖2)。由XPS結(jié)果(圖3)可知，CDs的主要元素組成是C、N、O，并且有吡啶氮、吡咯氮、石墨氮等結(jié)構(gòu)存在。高分辨XPS結(jié)果(圖4)表明，CDs ENMs表面具有多種親水官能團(tuán)，與FTIR結(jié)果非常一致。這些官能團(tuán)賦予了CDs優(yōu)異的水相分散性。據(jù)報(bào)道，含有sp2和sp3混合結(jié)構(gòu)的氧化石墨烯，可以作為優(yōu)良的水分傳遞劑，增加土壤保水作用，從而促進(jìn)種子萌發(fā)[12]。因此，擁有相似結(jié)構(gòu)的CDs ENMs可能也有類似的水分傳遞作用。