摘要 [目的]探索豬血漿白蛋白的高效提取方法。[方法]對低溫乙醇法在豬血漿白蛋白提取中的適用性進行了研究，設定豬血漿白蛋白提取步驟，并對離心速度、反應時間、pH、適用溫度4個關鍵參數(shù)進行優(yōu)化，對目標蛋白進行定性定量分析。[結果]低溫乙醇法適合提取豬血漿白蛋白，最佳提取條件為離心速度8 000 r/min，反應時間90 min，pH 4.7，溫度-8 ℃;采用改良后的低溫乙醇法，1 L豬血漿可提取白蛋白29.3 g，產(chǎn)品純度為97.3%，提取時長約10 h。[結論]改良后的低溫乙醇法是一種高效提取豬血漿白蛋白的可靠方法。

　　關鍵詞 豬血漿;白蛋白;提取;低溫乙醇法;優(yōu)化

　　隨著養(yǎng)豬業(yè)的迅猛發(fā)展，豬血等副產(chǎn)品產(chǎn)量急劇增加。據(jù)統(tǒng)計，2018年我國豬血產(chǎn)量接近200萬t，其中被收集利用的不到50%[1]。如何充分利用豬血資源開發(fā)高附加值產(chǎn)品，是擺在科研人員面前的現(xiàn)實課題[2]。

　　血液占活豬體重的3%～5%，主要由血漿和血細胞組成，其中血漿占血液總體積的55%，蛋白質(zhì)約占血漿總質(zhì)量的6.0%～7.5%。豬血漿含有豐富的纖維蛋白原、白蛋白、球蛋白、凝血因子等活性蛋白，是極具開發(fā)價值和開發(fā)潛力的稀有蛋白[3]。因此，從豬血中提取各種活性蛋白，是生物藥物行業(yè)的現(xiàn)實需求。

　　隨著血液蛋白提取技術的日益成熟，大量具有生物活性的血漿源蛋白被提取出來，并最終形成高附加值的醫(yī)療產(chǎn)品，極大地促進了疾病治療和生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。血漿中的白蛋白因在血液循環(huán)、滲透壓維持、解毒、脂類代謝以及物質(zhì)運輸、抗氧化等方面發(fā)揮著非常重要的生理功能，已在醫(yī)療領域得到廣泛應用[5-6]。血漿白蛋白臨床用量的不斷增加以及血源短缺，血漿白蛋白供不應求，需大量進口以彌補市場需求。據(jù)統(tǒng)計，2013、2014、2015、2016、2017年我國進口人血白蛋白分別占白蛋白簽發(fā)總量的46.39%、57.79%、55.59%、58.76%和 59.83%。因豬與人類之間的基因相似度達83%，且飼養(yǎng)管理與疾病預防控制水平日趨成熟，使得從豬血漿中提取白蛋白并加改造修飾以替代人血漿白蛋白具有較大的可能[7]。學者對人血漿白蛋白提取研究與應用一直沒有停步[8-9]，鹽析法、利凡諾法、熱乙醇法等多種提取方法先后建立并被應用，但產(chǎn)品品質(zhì)不高、操作復雜、成本過高、耗時過長、對環(huán)境及設備要求嚴苛以及有害物殘留等不足也逐漸呈現(xiàn)，這些問題阻礙了血漿白蛋白產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[10]。

　　為開發(fā)豬血漿白蛋白資源，筆者對低溫乙醇法的適用性進行了研究，并確定了離心速度、反應時間、pH、適用溫度等豬血漿白蛋白提取關鍵參數(shù)，旨在為豬血漿白蛋白的規(guī)模化制備提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 原料血漿

　　豬血漿由南岳山區(qū)生物資源保護與利用湖南省重點實驗室制備，具體方法為：采集新鮮豬血，按照9∶1的比例添加3.8%(M/V)的檸檬酸三鈉，攪拌均勻，進行抗凝處理。抗凝血液于4 ℃、1 000 r/min離心30 min，獲取上清液，再于4 ℃、3 000 r/min離心30 min，再次獲取上清液。反復數(shù)次，直至得到清亮的血漿。離心所得血漿分裝后，-20 ℃儲藏備用。

　　1.2 主要試劑

　　無水乙醇購自湖南匯虹試劑有限公司，檸檬酸三鈉、丙烯酰胺、過硫酸銨、異丙醇、甘油、TEMED、2-ME等購自上海易恩公司，標準酪蛋白購自Sigma公司，甲雙叉丙烯酰胺、蛋白Mark、SDS購自北京Slarbio公司，溴麝香草酚藍購自上海瑞永公司。

　　1.3 主要儀器

　　低溫離心機，Eppendorf;低溫恒溫槽，江蘇恒諾儀器制造有限公司;可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司;pH計，優(yōu)特儀器有限公司;凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司;蛋白超濾系統(tǒng)，美國PALL公司;全自動電泳儀，美國海倫娜公司。

　　1.4 試驗方法

　　1.4.1 豬血漿蛋白含量的測定。采用雙縮脲法測定豬血漿蛋白濃度，各成分配比見表1。具體操作為：將血漿與試劑按表1配比混勻，37 ℃水浴20 min后冷卻至室溫，在紫外分光光度計波長540 nm處進行吸光度值檢測，換算得濃度數(shù)據(jù)。

　　1.4.2

　　豬血漿白蛋白的初步分離。①用0.9% 的NaCl溶液稀釋血漿至蛋白含量5%左右，用1 mol/L的檸檬酸調(diào)pH至6.5～6.8，降溫至(1.0±0.5)℃，緩慢加入-15 ℃、95%的乙醇(按每1 000 mL血漿制品加267 mL 95%乙醇計算，并控制乙醇終濃度為20%)，邊加入邊攪拌，加完后復調(diào)pH至6.5～6.8。待溫度至-4.5～-5.0 ℃時開始離心，離心溫度控制在-3.0～-5.0 ℃，離心至上清液澄清，去沉淀，取上清液備用。②取上清液，用1 mol/L的醋酸緩沖液調(diào)pH至6.5～6.8，緩慢加入95%的冰乙醇，邊加入邊攪拌，控制最終乙醇濃度為40%左右，加完后復調(diào)pH至6.5～6.8，整個反應溫度控制在-4.2～-5.0 ℃，離心至上清液澄清，棄沉淀，收集上清液。③取上清液，用2 mol/L的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.7～4.8，在低溫條件下(-5.0～-7.0 ℃)離心至上清液澄清，取沉淀，沉淀即為血漿白蛋白。

　　1.4.3 豬血漿白蛋白純化及過濾。配制沉淀量5倍的8.5%乙醇溶液作為溶解液，溫度控制為3.0～5.0 ℃。白蛋白沉淀稱重后放入溶解液中，攪拌至沉淀完全溶解，此時反應溫度控制在-3.0～-3.5 ℃。待沉淀完全溶解后，用除菌濾膜過濾至濾液澄清，壓濾不超過0.2 MPa。

　　用1 mol/L碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至6.8～7.1，中空纖維超濾脫醇，濃縮蛋白濃度至10%～13%，采用9倍純水連續(xù)等體積透析，使蛋白終濃度為20%，按1 g蛋白質(zhì)加入0.165 mmol 辛酸鈉，并用1 mol/L碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至6.8～7.2后進行過濾除菌，將成品進行分裝、低溫凍存。

　　1.4.4

　　豬血漿白蛋白的定性定量鑒定。采用SDS-PAGE法測定豬血漿白蛋白分子量，具體操作如下：采用5%濃縮膠、10%分離膠，依次上樣后，上層80 V電泳30 min，下層120 V電泳60 min，用凝膠成像系統(tǒng)對SDS-PAGE 電泳結果進行圖譜分析。

　　取0.1 g凍干后的粗蛋白沉淀，充分溶于100 mL的純凈水中，利用全自動電泳分析儀完成蛋白定量檢測，直接獲取蛋白純度和含量數(shù)據(jù)。

　　1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法。采用SPSS 15.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

　　2 結果與分析

　　2.1 白蛋白的定性定量檢測

　　SDS-PAGE電泳圖譜分析結果見圖1。由圖1可見，提取產(chǎn)物在6.64 kD處出現(xiàn)標志性條帶，與豬血白蛋白標準品條帶大小一致。全自動電泳分析儀獲得掃描圖像(圖2)，結果顯示，豬血漿白蛋白峰單一且集中，說明提取的蛋白純度較高。

　　2.2 離心速度對豬血漿白蛋白提取結果的影響

　　由檢測結果可知，離心速度對豬血漿白蛋白得率和純度存在顯著影響，具體見表2。

　　由表2可知，離心速度在8 000 r/min時，目標蛋白的得率和純度顯著高于6 000和10 000 r/min，說明8 000 r/min的離心速度適合豬血漿白蛋白的提取。

　　2.3 反應時間對豬血漿白蛋白提取結果的影響

　　檢測結果表明，反應時間對豬血漿白蛋白的提取純度存在顯著影響(表3)。

　　由表3可知，乙醇與血漿蛋白作用時間為120 min時，蛋白得率和蛋白純度最高，但與作用90 min時沒有顯著差異，為節(jié)約時間、提高提取效率，反應時間采用90 min。

　　2.4 pH對豬血漿白蛋白提取結果的影響

　　由表4可知，當環(huán)境pH為4.7時，目標蛋白的得率和純度最高，且顯著高于pH為4.0和5.4時的得率和純度。

　　2.5 反應溫度對豬血漿白蛋白提取結果的影響

　　結果見表5。由表5可知，溫度為-8 ℃時，目標蛋白的得率和純度顯著高于-4和-12 ℃，說明提取豬血漿白蛋白的適宜溫度為-8 ℃。

　　3 結論與討論

　　由于豬的遺傳背景、器官大小、形態(tài)和功能與人有著高度的相似性，故豬血液制品在醫(yī)療領域的應用越來越受到廣泛關注，特別是現(xiàn)在白蛋白在醫(yī)療方面的廣泛應用以及人血的供應不足，導致對豬血白蛋白替代人血白蛋白的研究越來越引起學者的關注[11]。豬血白蛋白替代人血白蛋白的首要問題是從豬血漿中獲得高質(zhì)量的白蛋白。

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