摘要：外來植物入侵對我國農業(yè)生產的危害極大，已成為制約農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素之一。利用可培養(yǎng)方法，從入侵植物刺萼龍葵及其近緣非入侵植物少花龍葵體內分別分離出11株和5株內生細菌，其中芽孢桿菌種類居多，兩者共有的種類包括貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌3種;不同內生菌在兩類植物體內根、莖、葉不同部位分布具有一定的差異性。研究結果為闡明入侵植物刺萼龍葵的入侵機制提供了理論基礎。

　　關鍵詞：內生菌;植物入侵;刺萼龍葵;少花龍葵

　　外來生物入侵威脅農田環(huán)境生態(tài)安全、農業(yè)生產和人類健康，因此受到各國研究者的廣泛關注。刺萼龍葵(Solanum rostratum)又稱刺茄、黃花刺茄，是茄科茄屬的一種有嚴重危害的惡性植物，在我國被列為具有較大入侵危險性的檢疫植物。少花龍葵(Solallum nigrum)別名白花菜，是茄科一年生草本植物，其為刺萼龍葵的近緣非入侵種。植物內生菌與高等植物在長時間的協(xié)同進化中，與植物體內物質或根際分泌物等相互作用，提高宿主植物養(yǎng)分吸收能力、抗逆性、抗氧化性及次生代謝產物生產能力等，通過促進宿主植物的生長來提高其入侵能力。

　　目前，國內外對刺萼龍葵的研究多集中在傳粉機制、生物學特性、萌發(fā)特性、除草劑篩選及土壤根際微生物群落的影響等方面，很少探討入侵植物和其近緣非入侵植物內生菌多樣性的差異，以及其對植物入侵能力或過程的影響等。本課題主要通過可培養(yǎng)分離方法，探討比較入侵植物刺萼龍葵和其近緣非入侵植物少花龍葵植物內生菌種類的差異，以揭示植物內生菌在植物入侵過程中可能發(fā)揮的作用。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料與試劑

　　試驗所用刺萼龍葵、少花龍葵種植于常熟理工學院溫室大棚內，種植時間為2018年5月27日—8月25日，于2018年8月植株成年時期采集，帶回實驗室進行內生菌的分離。Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒：杭州博日科技股份有限公司;Taq酶：日本Takara(寶)生物股份有限公司。內生菌分離選用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。

　　1.2 儀器與設備

　　DHP9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海索譜儀器有限公司;PCR擴增儀：美國BIO-RAD公司;化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司。

　　1.3 試驗方法

　　1.3.1 內生菌的分離、純化 將植株切碎塊研磨成勻漿菌懸液，依次用生理鹽水梯度稀釋，得到菌懸液，涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，做2個重復，進一步培養(yǎng)觀察。根據(jù)肉眼觀察，對菌落進行分類、標記。多次純化直至得到單一菌落，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

　　1.3.2 基因組DNA提取及16S rDNA片段PCR擴增 提取內生菌基因組總DNA，并以其為模板，采用細菌通用引物Eu-bac 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3')和Eu-bac 1492R (5'-GGTTACCTTGTTAC-GACTT-3')對細菌基因組的16S rDNA序列進行擴增。

　　1.3.3 菌株序列測定與比對 將內生菌菌株送至蘇州金唯智測序公司進行測序，得到序列結果分別與NCBI中Genbank數(shù)據(jù)庫中親緣關系相近的菌種利用BLAST軟件進行比對，查找相似度最高的序列，確定菌株的分類學地位，并在此基礎上利用MEGA7.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

　　2 結果與分析

　　將測得的序列與NCBI中Genbank數(shù)據(jù)庫進行比對，找出相似度最高的完整序列，最終歸類、確定內生菌的種類。從刺萼龍葵中分離出11株內生菌，其中10株為芽孢桿菌屬，分別為貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌、耐熱芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、賴氨酸芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、米虎芽孢桿菌，1株為微小桿菌屬(見表1)。從少花龍葵分離出5株內生菌，其中3株內生菌為芽孢桿菌屬，分別為貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌，2株分別為泛菌屬和微桿菌屬(見表2)。

　　由表1和表2可知：入侵植物刺萼龍葵中內生菌的種類多于其近緣非入侵植物少花龍葵。刺萼龍葵與少花龍葵共有的菌有3種，分別為貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌。芽孢桿菌是一類植物根際促生菌，對植物生長具有重要作用。很多研究都從不同種類入侵植物內分離到了芽孢桿菌。石青等人發(fā)現(xiàn)，入侵植物黃頂菊聚集對自身有益的功能性細菌(耐寒短桿菌和巨大芽孢桿菌)，并通過化感物質直接或間接地促進生長，同時對一些病源微生物(尖孢鐮刀菌等)有抑制作用，從而成功入侵。以往研究顯示，貝萊斯芽孢桿菌能夠產生生防因子，防治植物病害，促進生長;枯草芽孢桿菌具有促生長效果和產吲哚乙酸(IAA)能力;解淀粉芽孢桿菌分泌脂肽類抗菌物質，產生拮抗作用，通過營養(yǎng)與空間的競爭，誘導寄主產生抗性和促進植物生長。這3種菌均具有抗病促生、改良土壤微環(huán)境的作用。

　　在一定程度上，刺萼龍葵體內的內生菌種類比少花龍葵多8種，這些內生菌除了上述作用外，其中的賴氨酸芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌是解磷生物，可增強植物對磷的利用率，提高營養(yǎng)物質、微量元素及礦質元素的吸收率，從而促進種子萌發(fā)和幼苗生長;微小桿菌屬、耐熱芽孢桿菌可作為優(yōu)勢菌株調節(jié)菌群，降解土壤污染有機物，減少其對植株的毒害作用。此外，少花龍葵中還分離出泛菌屬、微桿菌。研究發(fā)現(xiàn)，泛菌屬具有固氮作用，在一定程度上增強了少花龍葵作為本土植物的抵抗力。

　　內生菌在植物的根、莖、葉中分布規(guī)律略有不同(見表3)。對于入侵植物刺萼龍葵來說，根內的微生物種類最多，有除微小桿菌外的10種內生菌，莖部有4種內生菌，葉部有3種內生菌;貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌在3個部位均有分布。對于非入侵植物少花葵來說，根、莖和葉分別有4種、3種和2種內生菌;貝萊斯芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌在3個部位具有分布，而泛菌屬僅在莖部分布。與刺萼龍葵不同，解淀粉芽孢桿菌僅在少花龍葵根內分離到。解淀粉芽孢桿菌可以產生赤霉素、吲哚乙酸、細胞分裂素等多種生理活性物質和氨基酸類物質，起到促進植物根系及植株生長、增強植物抗病性的作用，從而間接地減少病害。

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