摘要：【目的】苦瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌苦瓜專化型(Fusarium oxysporum f.sp.momodicae)侵染引起的一種重要土傳病害。為有效防控該病害，對其病原菌進行綠色熒光蛋白基兇(gfp)標(biāo)記，為研究病原菌在苦瓜植株體內(nèi)的侵染特性提供可視化跟蹤檢測手段。【方法】采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法對苦瓜枯萎病原菌強致病性野生型菌株FJAT-3018進行綠色熒光蛋白基兇(gfp)標(biāo)記，通過對轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)觀察、生長速率和致病性測定，篩選出遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。【結(jié)果】野生型菌株FJAT-3018的轉(zhuǎn)化效率約為14.5個轉(zhuǎn)化子/106個孢子。經(jīng)10次繼代培養(yǎng)，篩選獲得的轉(zhuǎn)化子在菌落形態(tài)、生長速率和致病性方面與野生型菌株FJAT-3018無明顯差異，gfp基兇在轉(zhuǎn)化子的菌絲體和分生孢子中均能強表達;通過激光共聚焦顯微鏡掃描跟蹤發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子能夠在苦瓜植株根部和莖部侵染與定殖。【結(jié)論】綠色熒光蛋白基因已成功轉(zhuǎn)入到苦瓜野生型菌株FJAT-3018中，其轉(zhuǎn)化子具有良好的遺傳穩(wěn)定性且致病力不受影響。

　　關(guān)鍵詞：苦瓜;枯萎病;綠色熒光蛋白;基因標(biāo)記

　　0引言

　　【研究意義】苦瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌苦瓜專化型(Fusarium oxysporum f.sp.Momodicae)侵染引起的一種毀滅性土傳病害，該病害在苦瓜整個生育期均可發(fā)生，并導(dǎo)致植株萎蔫死亡，造成產(chǎn)量損失，嚴(yán)重制約了苦瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。為有效防控該病害，亟需了解該病原菌對苦瓜的侵染特性。因此，建立一種可視化的跟蹤標(biāo)記手段，有助于深入研究該病原菌的侵染過程和指導(dǎo)該病害防控。【前人研究進展】綠色熒光蛋白標(biāo)記基因(gfp)可為研究病原菌在植株體內(nèi)的侵染蔓延提供可視化跟蹤技術(shù)[3]。它具有熒光性質(zhì)穩(wěn)定、直觀、操作方便和不需要添加外源底物就可以在活細(xì)胞中直接檢測等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于真菌分子生物學(xué)研究[4-5]。適用于鐮刀菌屬真菌的gfp基因轉(zhuǎn)化方法有多種，如PEG介導(dǎo)法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍介導(dǎo)法等[6-8]。其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法是直接以真菌孢子或菌絲為受體，較PEG介導(dǎo)法和基因槍介導(dǎo)法的操作更簡單，可減少轉(zhuǎn)化過程中其他因素的影響，且轉(zhuǎn)化效率和遺傳穩(wěn)定性也更高[9]。【本研究切入點】目前，國內(nèi)外學(xué)者已利用gfp基因成功標(biāo)記了番茄、香蕉、甜瓜和玉米等寄主作物尖孢鐮刀菌[10-14]，但未見苦瓜枯萎病原菌的gfp基因標(biāo)記的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】為有效防控該病害，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法對苦瓜枯萎病原菌強致病性野生型菌株FJAT-3018進行綠色熒光蛋白基因(gfp)標(biāo)記，并比較轉(zhuǎn)化前后菌株的菌落形態(tài)、生長速率和致病性差異，篩選m遺傳穩(wěn)定標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子，有助于通過可視化跟蹤觀察深入研究該病原菌的侵染過程和指導(dǎo)該病害防控。

　　1材料與方法

　　1.1試驗材料

　　苦瓜枯萎病原菌強致病菌株FJAT-3018屬于尖孢鐮刀菌苦瓜專化型(Fusarium oxysporum f.sp.Momodicae)，由本研究室保存;供試苦瓜感病品種(新翠)植株購自廈門如意種苗高科技股份有限公司;農(nóng)桿菌AGL-1菌株由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈，載體pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供;潮霉素B、卡那霉素、特美汀等抗生素均購白美國Sigma公司;PDB培養(yǎng)基(200g馬鈴薯，15g葡萄糖，加水定容至1000 mL);PDA固體培養(yǎng)基(200g馬鈴薯，15g葡萄糖，15g瓊脂粉，加水定容至1000mL)，篩選培養(yǎng)基(含終濃度為100μg·mL-1潮霉素B和200μg·mL-1特美汀的PDA固體培養(yǎng)基);農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化所需的試劑及3種培養(yǎng)基配方(基礎(chǔ)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基和共培養(yǎng)培養(yǎng)基)參考文獻[15]，具體配方見表1。混合纖維微孔濾膜(購白上海生工).0.22μm微孔過濾器(Millipore)。

　　1.2苦瓜枯萎病菌的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化

　　采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行苦瓜枯萎病菌的gfp基因轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化方法參照文獻[15]，略做改動。具體步驟如下：(1)苦瓜枯萎病原菌菌株FJAT-3018于含200μg·mL-1硫酸鏈霉素的PDA固體培養(yǎng)基純化培養(yǎng)7d，在培養(yǎng)皿中加入適量無菌水，用無菌涂布棒刮洗菌落表面洗出分生孢子，孢子懸浮液用雙層無菌擦鏡紙過濾，并用誘導(dǎo)培養(yǎng)基調(diào)整分生孢子濃度為1×106個·mL-1備用。(2)將已轉(zhuǎn)入pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp載體的農(nóng)桿菌AGL-1用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM培養(yǎng)基)于28℃、250r·min-1搖床培養(yǎng)48h，后用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM培養(yǎng)基)調(diào)整菌液濃度為OD600=0.15，繼續(xù)搖床培養(yǎng)約6h至菌液OD600約為0.60。(3)將滅菌的混合纖維微孔濾膜放置在共培養(yǎng)培養(yǎng)基(CM培養(yǎng)基)上，并取已制備好的FJAT-3018孢子懸浮液和農(nóng)桿菌液各100μL混勻后于混合纖維微孔濾膜上均勻涂布，10個重復(fù)，并于25℃暗培養(yǎng)48h。(4)共培養(yǎng)48h后，將混合纖維微孔濾膜用無菌刀片劃成小塊分散擺放到篩選培養(yǎng)基(含終濃度為150μg·mL-1潮霉素B和200μg·mL-1特美汀的PDA培養(yǎng)基)上，于28℃暗培養(yǎng)72h。(5)篩選培養(yǎng)基平板放置在BD-BGC1藍(lán)光切膠儀中，挑取發(fā)出明亮綠色熒光菌落邊緣的菌絲體于篩選培養(yǎng)基上復(fù)篩，繼續(xù)用藍(lán)光切膠儀挑選出發(fā)出明亮綠色熒光的平板，并通過單孢分離法獲得相對應(yīng)轉(zhuǎn)化子。

　　1.3轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性檢測

　　單孢分離純化獲得的強綠色熒光表達的不同轉(zhuǎn)化子在PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)6d后，選取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)以上方法連續(xù)培養(yǎng)10代，觀察各轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)變化，測量菌落生長速度，以野生型菌株FJAT-3018為對照。挑取熒光強且遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子于-80℃甘油冷凍保存，同時挑取代表性轉(zhuǎn)化子的菌絲體制成玻片，置于熒光顯微鏡下觀察菌絲和孢子的熒光強度。

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