關鍵詞 溴鼠靈;急性毒性;斑馬魚;運動行為
近年來，毒鼠強、氟乙酰胺等急性強效殺鼠劑逐漸被禁用，目前較常見的殺鼠劑主要是第二類抗凝血殺鼠劑。與第一類抗凝血類殺鼠劑相比，第二代抗凝血殺鼠劑的毒性更強，毒力持續時間長，因此在農業生產中得到了廣泛使用[1-2]。此類殺鼠劑的大量使用可能導致部分藥物殘留進入土壤、水體等環境中，引發水資源污染、食品污染等一系列問題，進而危害水生生物甚至人類的生命健康[3]。以溴鼠靈為代表的第二代抗凝血類殺鼠劑對環境造成的污染問題越來越嚴重，也逐漸引起人們的重視。茅海瓊等[4]首次研究溴鼠靈在水環境突發性污染事故中的痕量殘留，采用超高效液相色譜串聯質譜法進行檢測，其檢出限可達0.08 μg/L。宓捷波等[5]建立了蔬菜及水果中溴鼠靈高效液相色譜-質譜分析方法，檢出限可達0.5 μg/kg。
溴鼠靈(brodifacoum)又稱大隆、溴鼠隆，是第二類抗凝血殺鼠劑的典型代表，也是目前應用最廣泛的殺鼠劑，其中文名稱為3-[3-(4′-溴聯苯-4-基)-1，2，3，4-四氫-1-萘
基]-4-羥基香豆素，屬于4-羥基香豆素類衍生物殺鼠劑[6]。與其他抗凝血類殺鼠劑作用機制類似，當溴鼠靈進入機體后，阻礙肝臟合成凝血酶原及一些凝血因子在肝臟的合成，造成各個臟器及黏膜大量出血而死亡[7-8]。由于使用不當、誤食而引起的抗凝血類殺鼠劑的中毒事件屢見報道[9-10]，在國內甚至出現了利用抗凝血類殺鼠劑進行投毒的案件[11]。目前，針對溴鼠靈等抗凝血類殺鼠劑的研究主要集中在中毒案例的救治[12-13]、生物樣品中藥物的檢測等領域[3，14-15]，目前尚缺乏能在短時間內實現對溴鼠靈等抗凝血類殺鼠劑的快速、有效且準確的檢測方法。因此，有必要開發高效、快速、靈敏的針對溴鼠靈急性毒性檢測手段，為及時、有效地預防和預警此類事件提供必要的技術支持和數據支撐。
斑馬魚(Danio rerio)是近年來新興的模式動物，其基因與人類具有80%以上的高度同源性，并且具有成本低、通量高、試驗周期短、靈敏度高、毒性生理指標豐富等優點[16]，被國際經濟合作組織(Organization for Economic Cooperation and Development，OECD)列為實驗室測試的推薦實驗物種。我國也出臺了《水質物質對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定方法》將斑馬魚應用于水質檢測。目前，國內外越來越多的學者以斑馬魚為模型開展藥物篩選[17-18]、化合物毒性評估[19-20]、環境監測[21-22]等領域的研究。Rihel等[23]首次利用斑馬魚模型的行為學參數實現了神經毒性化合物的篩查，在對明暗交替環境刺激模式下的斑馬魚運動行為參數分析后，從5 648個化合物中篩選出對斑馬魚有神經毒性的化合物547個。筆者以斑馬魚為實驗動物，研究2 h內溴鼠靈暴露對斑馬魚幼魚的急性毒性以及溴鼠靈對斑馬魚幼魚運動行為的影響，建立短時間內溴鼠靈斑馬魚的中毒模型，以期為短時間內溴鼠靈毒性評估提供試驗數據和理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要材料
試驗所用的親代斑馬魚均購自中國科學院水生生物研究所國家斑馬魚資源中心，自繁的第一代用于試驗，在自動水循環養殖系統中進行養殖，水環境電導率400～540 μS/cm，pH 7.0～7.6，水溫(28.0±0.5)℃。魚缸和過濾墊每周清理1次，去除糞便，飼養光周期控制光暗比為14∶10。每天10∶00和15∶00分別投喂鮮活豐年蝦餌料1次。
E3培養液的配制：分別稱取NaCl 17.2 g、KCl 0.76 g、CaCl2 2.91 g、MgSO4·7H2O 4.9 g，用雙蒸水溶解后配制成1 L的E3培養液。常用試劑購自國藥集團化學試劑有限公司，4 ℃ 下保存，14 d內使用。溴鼠靈標準品由杭州市公安局刑事科學技術研究所提供。因溴鼠靈微溶于水，20 ℃時在水中的溶解度僅為10 mg/L。試驗前，用二甲基亞砜(DMSO)將溴鼠靈配制成母液，逐級稀釋到所需試驗濃度，暴露溶液均為現配現用，確保各濃度組DMSO最終體積分數小于0.5%，對照組DMSO體積分數為0.5%(經預試驗可知，當DMSO體積分數為0.5%以下的處理與空白組處理無顯著差異，對胚胎期斑馬魚的發育以及幼魚的運動行為均無影響)。
主要儀器設備有Lab Tower EDI純水系統(美國賽默飛世爾公司)、恒溫培養箱(上海龍躍儀器設備有限公司)、DanioVision行為觀測系統(荷蘭諾達思信息技術公司)、電子分析天平(德國賽多利斯公司)、ZW-H3000體式顯微鏡(中國深圳中微科創公司)等。
1.2 實驗動物
試驗前12 h，選擇6～12月齡的健康性成熟斑馬魚按照雌雄1∶2的比例放置在孵化盒中，用透明玻璃板將雌、雄斑馬魚分隔開，在黑暗安靜環境下放置14 h。次日早晨，將雌、雄斑馬魚中間隔板抽離并給予光照刺激，使雌、雄斑馬魚在光照刺激下進行交配產卵，約0.5 h后收集受精卵。用 E3培養液沖洗受精卵2～3次去除雜質，6 h后在體視顯微鏡下觀察去除未受精以及形態有缺陷的胚胎，挑選出正常發育的斑馬魚胚胎于28 ℃恒溫培養箱中控光培養用于試驗。
1.3 急性毒性試驗
參考國際經濟合作組織(OECD)魚類急性水生毒性試驗設計暴露試驗，急性毒性試驗采用6孔板，每孔內放置30尾6日齡(6dpf)幼魚，每孔加注溴鼠靈溶液6 mL，溴鼠靈濃度設置為0.01、0.10、1.00、10.00、50.00、100.00 mg/L。加魚、加藥時間控制在10 min內，試驗開始后記錄2 h內斑馬魚幼魚的死亡數量，根據試驗需要可適當調節濃度設置，以便于計算半數致死濃度(LC50)，拍照并記錄染毒后幼魚的形態變化。
1.4 運動行為試驗
斑馬魚幼魚的運動行為學試驗溴鼠靈濃度設置為0.01(Ⅰ)、0.10(Ⅱ)、1.00(Ⅲ)、10.00(Ⅳ)、50.00(Ⅴ)、100.00 mg/L(Ⅵ)，每個濃度組隨機選擇12尾6日齡斑馬魚幼魚放入96孔板中，每孔1尾，將96孔板置于斑馬魚行為觀測系統箱體內。參考Mcgrath[24]報道的采用光暗交替刺激條件，系統設置10 min光照、10 min黑暗的明暗交替模式，循環6次，共記錄2 h內斑馬魚幼魚的運動軌跡，受試魚在試驗前適應10 s。主要測試斑馬魚幼魚在2 h內的自由運動行為。使用EthoVision XT 14軟件分別記錄各濃度組幼魚的運動軌跡，計算運動的總距離、平均速度、運動熱圖以及各濃度組藥物毒性起效時間、受強光刺激后的運動加速度等行為參數。
1.5 強光刺激應激試驗
藥物濃度設置、孔板選用及加藥方式均與斑馬魚運動行為試驗設置一致。參考文獻[25]報道的強光刺激試驗方法，并進行適當調整：在斑馬魚幼魚染毒60 min 后開啟強光照射刺激，采集并記錄第59～61 min斑馬魚幼魚的運動速度和加速度。
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