摘 要：目的：探究西藏工布烏頭和露蕊烏頭2種藥用植物植株莖內內生菌。方法：采用培養基培養法和載玻片法對分離得到的菌株進行形態學分析，并利用分子生物學技術提取菌株DNA進行測定。結果：從2種西藏烏頭屬藥用植物中獲得的2株菌株，均屬于半知菌亞門曲霉屬環繞亞屬黑色組的真菌。

　　關鍵詞：西藏;藥用植物;內生菌;DNA;烏頭屬

　　內生菌(Endophyte)一詞最早是由德國科學家de Bary首先提出的，早期定義是指生活在植物組織內的微生物。在長期的研究過程中，由于不同科研工作者研究的植物、角度、目的及得到的結論不盡相同，因此“內生菌”的概念和解釋被多次修改。截至目前，普遍被認可的“內生菌”的概念是指生活史中某一時期生活在植物體內而其本身對植物組織不會引起明顯病害癥狀的微生物類群。一般認為，植物內生菌與宿主互惠共生、協同進化。

　　近年來，隨著生態學及醫學研究的不斷深入，國內外專家學者及相關的科研工作者對植物內生菌的研究越來越多。大量研究表明：植物內生菌在植物生命過程中起著十分重要的作用，主要體現在對植物的生長發育、次生代謝、應對生物脅迫等方面具有重要的作用[1]。目前，關于植物內生菌的研究已經滲透到醫學、中藥學、生態學、微生物學、植物病理學等多個學科領域。自Vogl于1898年成功從黑麥草(Lolium tu-melentum)的種子中分離得到第1株內生真菌以來[2]，已有很多研究者從不同植物中分離得到了不同種類的植物內生菌。眾多的研究成果不僅豐富了內生菌種類，更加深了人們對內生菌的認識。目前，關于植物內生菌的研究和報道較多的是從不同植物內生菌內發現一些具有天然活性的代謝產物，主要包括萜類、黃酮類、內酯類、酚類、多肽類等[3，4]。可見，植物內生菌作為一種重要的微生物資源，是新型天然活性物質的重要來源之一。

　　西藏植物資源豐富，尤其是藥用植物，其中烏頭屬植物在我國作為藥材的應用已有很長的歷史。據文獻記載，烏頭屬植物的主要化學成分是烏頭堿，并含有多糖、香豆素、黃酮、甾體等化學成分，具有調節免疫、麻醉止痛、抗炎和抗腫瘤等多重功效[5]。西藏現有烏頭屬植物73種，占全國烏頭屬植物總種數(含變種)的20.50%;該屬資源的豐富度在全國范圍內僅次于四川和云南，其中較明確的藥用種類有13種，占西藏烏頭屬植物總種數的17.81%[6]。西藏烏頭屬植物主要分布在海拔2000～5000m的高山草甸、山坡石隙、礫石草坡和灌木叢林等地[7]。

　　目前，關于烏頭屬藏藥研究較多的是在其化學成分及其結構以及生理活性等方面，尚未見對其內生菌的相關研究報道。植物內生菌按其種類一般分為內生細菌、內生真菌及內生放線菌3類。為探明西藏烏頭屬植物體內內生菌的存在及分類，本試驗對西藏2種常見的烏頭屬植物工布烏頭和露蕊烏頭莖內內生菌進行了分離與鑒定，以期為今后該屬植物資源的保護及烏頭屬藏藥的開發利用提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料

　　1.1.1 實驗樣品 工布烏頭和露蕊烏頭屬于毛茛目、毛茛科(Crassulaceae)、烏頭屬(Rhodio-la L.)的植物[8]。工布烏頭和露蕊烏頭植株，均采自西藏林芝市工布江達縣米拉山東坡，海拔4410m(北緯29°53′6″、東經92°20′19″)。

　　1.1.2 培養基及制備方法 采用PDA培養基(葡萄糖10g、土豆200g、瓊脂15g、蒸餾水)，定容到1000mL。

　　1.2 試驗方法

　　1.2.1 樣品處理 取工布烏頭和露蕊烏頭的莖用自來水反復沖洗后，再用醫用消毒水沖洗數遍，放入無菌操作臺內滅菌30min。然后將植物的莖切成3～4cm的小段，再縱向切開放入盛有次氯酸鈉溶液的燒杯中15min，之后分別用硫代硫酸鈉、乙醇和無菌水進行沖洗[9]，置于PDA培養基中進行培養。

　　1.2.2 菌株的形態觀察 將分離得到的菌株移至新的培養基中進行分離純化，再將純化后的菌株以點接方式，接種到新的PDA培養基中。待觀察到培養基表面有菌絲生長時，用已滅菌的醫用手術刀把培養基切成長和寬為2cm×2cm，之后移到已經滅菌的載玻片上，蓋上蓋玻片繼續培養[10]，設置智能溫控培養箱的溫度為25℃，濕度為60%～80%的范圍內，每2d觀察1次孢子的發育情況。

　　1.3 純化后菌株的分子生物學研究

　　1.3.1 菌株DNA的提取 挑取真菌菌絲添加到PBS緩沖液中，加入100U的Lyticase(sigma L4025)，于37℃條件下破壁處理30min。之后用真菌基因組DNA快速提取試劑盒(此試劑盒由寶信生物有限公司提供，貨號DN1112)提取基因組DNA，用于后續的基因擴增。

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