摘 要：在草魚飼料中添加不同劑量的殼聚糖，連續投喂42 d，研究殼聚糖對草魚非特異性免疫功能的影響。結果顯示，與對照組相比，殼聚糖可以提高血清溶菌酶活性、SOD活性、AKP活性、補體C3含量和血液白細胞吞噬活性，并能降低MDA含量。結果表明，飼料中添加5 g/kg的殼聚糖對草魚的非特異性免疫功能有最好的促進作用。
關鍵詞：殼聚糖;草魚(Ctenopharyngodon idellus);非特異性免疫
殼聚糖(chitosan，CS)又稱殼多糖，是由天然聚合物甲殼素經過脫乙酰作用而得，通常將脫乙酰度大于70%的稱為殼聚糖，其優點很多：良好的生物相容性、可自然降解性、粘膜吸附性、溶菌酶等可使其溶解、本身及其代謝物無任何毒副作用、調節生物體的免疫功能[1-3]。研究表明，殼聚糖對正常生理條件下和處于免疫功能低下的魚體的非特異性免疫功能均具有提高的功能[4-6]，添加適量的殼聚糖可以提高俄羅斯鱘幼魚的生長性能和免疫能力[7]。本試驗通過在草魚(Ctenopharyngodon idellus)基礎飼料中分別添加不同劑量的殼聚糖，研究其對草魚免疫功能的影響，以期為預防草魚疾病提供新方法。
1 材料與方法
1.1 試驗魚
試驗用草魚來自遼陽市東荒農場，暫養后從中挑選規格整齊、體質健壯的魚350尾(平均體質量108 g)，用3%的食鹽水溶液消毒后，隨機分成5組(每組25尾)，每組2個重復，放入10個(1.0 m×1.0 m×0.5 m)網箱中。設2個對照組。網箱放在7.5 m×7.5 m×1.5 m的水泥池中。
1.2 試驗設計
在基礎飼料(表1)中分別添加殼聚糖0 g/kg(C0組)、2.5 g/kg(C1組)、5 g/kg(C2組)、7.5 g/kg(C3組)、10 g/kg(C4組)。飼料原料經粉碎過40目篩后制粒，然后破碎成直徑為3 mm的顆粒備用。飼料配制時，所添加的中藥免疫增強劑以等量減少麥麩用量保持配方平衡。對照組投喂基礎飼料。基礎飼料組成及成分分析見表1。
1.3 試驗過程與飼養管理
在正式試驗開始之前，將草魚先暫養兩周后轉入網箱中。每天在早、中、晚三個時間投喂，投喂量為魚體重的4%。試驗地點在遼寧省淡水水產科學研究院試驗基地，試驗周期為42 d。試驗期間，控制水溫在23～28 ℃，DO保持在5 mg/L以上，氨氮小于0.3 mg/L。
1.4 非特異性免疫指標的測定
1.4.1 樣品的采集 在第42天時進行取樣，每箱取草魚3尾，于尾靜脈處采血，放入車載冰箱中保存，返回實驗室后，于4 ℃下，2 500 r/min離心15 min，收集上層血清，立即測定。
1.4.2 血清指標測定
溶菌酶活力按王雷等[8]的方法進行測定，溶菌酶活性(U)由下式計算：U=(A0- A)/A0，A0為初始光密度值，A為反應后光密度值。
超氧化物歧化酶活性、堿性磷酸酶活性、丙二醛采用南京建成生物技術研究所生產的試劑盒進行測定。補體C3含量采用浙江伊利康生物技術有限公司所生產的試劑盒進行測定。
白細胞吞噬活性的測定，于草魚尾靜脈處采血500 μL(采血管和注射器均提前用1%肝素潤洗)，加入200 μL嗜水氣單胞菌懸液(濃度為1×108 cfu/mL)，渦旋30 s，37 ℃水浴30 min(同時每隔5 min輕輕振蕩一次，共振蕩4次)，靜置10 min。從表面吸取上清進行推片，自然干燥后，經過固定、染色1 min后，用油鏡進行觀察。以吞噬百分比計算吞噬活性。
吞噬百分比=(100個吞噬細胞中參與吞噬的細胞數/100)×100%。
1.5 數據分析與處理
試驗結果以平均值±標準誤表示，采用SPSS17.0統計軟件對試驗數據進行單因素方差分析和LSD多重比較進行統計分析，顯著水平為0.05。
2 結果
2.1 殼聚糖對草魚非特異性免疫功能的影響
由表2可知，溶菌酶活性隨著殼聚糖添加量的增加而增大，其中殼聚糖添加量為10 g/kg的溶菌酶活性顯著高于對照組(P<0.05);添加殼聚糖的超氧化物歧化酶活性均與對照組差異不顯著(P>0.05);殼聚糖添加量為5 g/kg的堿性磷酸酶活性最高，且與對照組差異顯著(P<0.05)，其余組別的堿性磷酸酶活性均與對照組差異不顯著(P>0.05);殼聚糖添加量為5 g/kg和7.5 g/kg的丙二醛含量顯著低于對照組(P<0.05)，其余組別的丙二醛含量均與對照組差異不顯著(P>0.05);補體C3含量隨著殼聚糖添加量的增加而先增加后降低，試驗組均高于對照組，其中殼聚糖添加量為5 g/kg時補體C3含量最高。
2.2 殼聚糖對草魚血液白細胞吞噬活性的影響
由圖1可知，白細胞吞噬活性隨著殼聚糖添加量的增加而先增加后降低，添加量為5 g/kg時達到最高，且試驗組均顯著高于對照組(P<005)。
3 討論
溶菌酶在魚類的非特異性免疫系統中占有重要的地位，也是評價非特異性免疫的重要指標，它對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有一定的殺滅作用，其作用機制是將細胞壁中乙酰基多糖水解并釋放出來，從而將侵入體內的異物進行破壞和消除，起到機體防御的作用[9-10]。常青[11]等發現，殼聚糖能夠提高花鱸機體的補體活性、增強溶菌酶活性和吞噬活性，并且還有一定的促生長作用。在本實驗中，殼聚糖添加量為10 g/kg的溶菌酶活性顯著高于對照組(P<0.05);而低添加量組的溶菌酶活性低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。超氧化物歧化酶能夠清除機體內多余的自由基，使自由基的生成與清除處于一種動態平衡中，它還與生物的免疫功能有著密切的關系[12-14]。本實驗中，試驗組的超氧化物歧化酶活性均略低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。這與王秀華[15]的研究結果一致。AKP通過改變致病菌的表面結構，來提高機體識別和吞噬致病菌的能力，進而達到提高魚體免疫力的作用[9-10]。在本實驗中，殼聚糖添加量為5 g/kg的組堿性磷酸酶活性最高，且與對照組差異顯著(P<0.05)。MDA的含量可以反映出機體遭受自由基攻擊的程度。在本實驗中，殼聚糖添加量為5 g/kg和7.5 g/kg時均可顯著降低MDA含量，過低和過高添加量對MDA含量沒有顯著影響。補體在非特異性體液免疫系統中有著特別重要的作用，而C3在補體中又有著重要作用，激活它可以起到殺菌、溶菌作用。在本實驗中，當殼聚糖添加量為5 g/kg時，草魚血清中補體C3的含量達到最高，但繼續增加殼聚糖，對補體C3含量反倒起到負作用，這與肖艷翼[7]和汪開毓[16]的研究結果相似。這說明，適量的殼聚糖可以激活草魚體內補體C3的活性，增強草魚的非特異性免疫功能，而過量的殼聚糖反而抑制了補體C3的表達。
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