摘 要：GLK轉錄因子隸屬于GARP家族，廣泛存在于高等植物中，其編碼的轉錄因子能夠起到促進葉綠體發育的調控機制，水稻中有一對GLK基因，分別為OsGLK1與OsGLK2。為深入探究該基因的功能，本文克隆了水稻中OsGLK2的啟動子序列，并對水稻GLK基因的表達進行分析。在OsGLK2啟動子上發現了8個TATA-box，13個CAAT-box，5個G-box位點;不同水稻種質上OsGLK2基因啟動子存在很大多態性，OsGLK1及OsGLK2主要在葉子及根中表達，不同種質間的表達差異明顯，3個基因型的表達量明顯低于及其他樣;分析發現CAAT-box是影響OsGLK2表達量的調控位點。

　　關鍵詞：水稻(Oryza sativa);GLK轉錄因子;啟動子;多態性;表達模式

　　水稻科學(英文版)主要刊登以水稻為研究對象的未經發表的英文原始論文、綜述、研究簡報、學術活動簡訊等，內容涉及水稻研究的各個領域。

　　GLK轉錄因子屬于GARP家族，普遍存在于高等植物中，能夠調控葉綠體的發育[1]。在擬南芥上，雙突變體 AtGLK1和 AtGLK2 在所有光合組織中呈淡綠色，呈現減少 Granal 類囊體葉綠體特征[1] ;而過表達 AtGLK1和 AtGLK2 使淡綠色表型更加突出[2]。ZmGLK1 同源到 Golden2 (G2)上，并且玉米 g2 突變體葉片顯淡綠色[3]。 從小立宛蘚(Physcomitrella patens)中分離 GLK 基因，表明它們規管在葉綠體發育中。因此，GLK 轉錄因子在植物上具有調節葉綠體發育的功能。

　　前人研究表明，水稻中有一對GLK基因，分別為OsGLK1與OsGLK2。OsGLK1 能直系同源到玉米 Golden2 - 1 (ZmGLK1) 基因[4]。插入突變體證明OsGLK1 和 OsGLK2 的作用可能類似，反映了一定程度的功能冗余[4]。含 OsGLK2-FOX 序列D 愈傷組織在 N6D 培養基上顯示綠色，OsGLK2野生型愈傷組織再生過程中表現出相似的表達模式[5]。本文對OsGLK2的啟動子進行克隆和序列分析，同時利用實驗室的豐富水稻種質資源，分析該基因在不同種質中的表達模式，旨在為深入認識GLK基因在水稻上的進化模式及在不同種質中的表達特性提供新信息。

　　1 材料與方法

　　1.1 植物材料

　　本實驗所用水稻材料來源于華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室，包括50份水稻突變體(L124-L173，表1)及對照中花11(ZH11)，采集開花后10天的葉、根、花以及成熟種子，液氮保存備用。

　　1.2 DNA提取

　　液氮將植物組織組織研磨成細粉，加入65℃預熱的2×CTAB抽提液1000μL和β-巰基乙醇4 μL，混勻，65℃溫育1.5 h，間斷混勻。12000 rpm離心10 min，轉移上清，加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)(v/v)，抽提上清，顛倒混勻7 min，12000 rmp離心10 min。轉移上清，再用等體積的氯仿/異戊醇(24：1)(v/v)抽提上清液，12000 rpm離心10 min，轉移上清。上清加入等體積的異丙醇，-20℃冰浴1 h。12000 rpm離心10 min，棄上清。75%酒精洗滌2次，用ddH2O溶解DNA。用Thermo 超微量核酸檢測儀檢測 DNA 濃度與質量。

　　1.3 RNA提取

　　根據實驗需取擬南芥一定部位材料0.1 g左右，液氮中研磨，加入500 μL RNAiso Plus(Takara)試劑分離RNA，震蕩均勻，室溫放置10 min。加入200 μL氯仿，震蕩，后靜置3 min 12000 g，4℃離心15 min。取無色水相層置入新的1.5 mL離心管中，加入與其體積相同的異丙醇，-20℃下靜置1 h，然后12000 g、4℃離心10 min。用75%乙醇洗滌兩次后晾干，用RNase-free水進行溶解，用Thermo 超微量核酸檢測儀檢測DNA 濃度與質量。

　　1.4 RNA反轉錄獲得cDNA

　　RNA反轉錄首先用DNAase去除RNA中的雜質DNA，后用Takara公司的5*PrimeScript RT Master Mix進行反轉錄，體系如下：5*PrimeScript RT Master Mix 2 μL，RNA 500 ng，添加ddH2O至10 μL。然后將混合液放入PCR儀，進行如下條件的反應：37℃ 15 min，85℃ 5 s。反應完成后將反轉錄得到的cDNA儲存在-20℃備用。

　　1.6 基因表達的qRT-PCR分析

　　本實驗采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)對基因表達量進行檢驗，儀器型號Bio-RAD CFX96。采用如下體系：cDNA 1 mg/μL，qRT-FP 5 μL，qRT-RP 0.5 μL，TransStart Top Green qRT-PCR SuperMix(全式金公司)7.5 μL，加dd H2O至15 μL。該實驗使用引物為GLK2-qRT-F：AGAGCATAGACGCAGCCATC，GLK2-qRT-R：TGCTTGTGCAGCTCAGACAT。qRT-PCR過程為：首先95℃預變性30 s，接著95℃變形30 s，56℃退火10 s，40個循環。實驗完成后，得到Ct值，計算相對表達量。

　　1.7 OsGLK2啟動子的克隆

　　擴增PCR反應體系為50 μL：TaKaRaprimSTAR(2×)25 μL，ddH2O 21 μL，模版 基因組DNA 2 μL，上下游引物(10 μM)各1 μL;擴增程序為98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min 30 s，37個循環。1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測擴增產物，用 SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒(生工，上海)對獲得的特異性擴增片段進行回收。該實驗使用引物為GLK2-Promoter-F：AAGCTTGCTCCACGCTTTCCAAGTTCCT，GLK2-Promoter-R：GGATCCCCCAAAATCTCTCCCCTCTACA。

　　對片段進行回收、克隆，反應體系：在微型離心管中依次加入PCR 產物 0.5～4 μL(根據PCR 產物量可適當增減，最多不超過4 μL)，pEASY- T3 Cloning Vector 1 μL輕輕混合，室溫 (20 ℃-37 ℃) 反應5 分鐘。反應結束后，將離心管置于冰上。

　　轉化過程：加連接產物于50 μL Trans1-T1感受態細胞中(在感受態細胞剛剛解凍時加入連接產物)，輕彈混勻，冰浴20～30 min。42℃熱激30 s，立即置于冰上2 min。加250 μL平衡至室溫的SOC/LB，200轉、37℃孵育1 h。 取8 μL 500 mM IPTG，40 μL 20 mg/mL X-gal混合，均勻地涂于準備好的平板(AIX培養基)上，在37℃ 放置30 min。待IPTG，X-gal 被吸收后，取200 μL 菌液鋪板，培養過夜。

　　用SanPrep 柱式質粒 DNA 小量抽提試劑盒(生工公司)提取質粒，酶切鑒定后選取合適的質粒送測序公司測序，測序引物用T7和SP6。

　　2 結果與分析

　　2.1 OsGLK2啟動子克隆

　　通過合適的PCR體系擴增得到了OsGLK2啟動子片段，所擴增片段大小在2000 bp 左右，符合目的片段大小。雖然電泳結果呈現輕微雜帶，但是經過對目的片段的切膠回收后，能夠保證目的片段的純度。取得該片段后，用目的片段連接測序載體p-Easy T3，轉化大腸桿菌，送到測序公司測序。

　　A.ZH11的OsGLK2啟動子PCR擴增結果;B.L124-L127的OsGLK2啟動子PCR擴增結果

　　圖1 OsGLK2啟動子部分PCR擴增結果

　　Fig.1 OsGLK2 promoter partial PCR amplification results

　　2.2 OsGLK2啟動子序列分析

　　為了探究啟動子序列對于OsGLK2基因表達的影響，對中花11(對照)中OsGLK2基因啟動子元件進行分析(圖1)。結果顯示，以主要的啟動子元件為例(表1)，OsGLK2上具有8個TATA-box，13個CAAT-box，5個G-box。以上調控元件主要功能是：TATA-box，核心啟動子;CAAT-box，增強子;G-box，光響應的順勢調控元件。

　　2.3 OsGLK2啟動子在不同種質中的多態性

　　以ZH11為參照，通過測序后的序列比對發現，50組水稻種質樣品均準確地克隆到了目的片段，即OsGLK2的啟動子。我們還分析了50份水稻種質資源在OsGLK2啟動子區的多態性位點，結果發現(表1)，許多種質在該區段部分都出現了堿基的突變，其中L132、L149及L160由于第1860位點的堿基發生突變(A/T)，造成了該位置CAAT-box被破壞;另外，L133的1265堿基發生突變(T/G)，造成該位置受到破壞。

　　2.4 OsGLK1及OsGLK2的表達分析

　　以ZH11為材料，取花、葉片(花后10 d)、根(花后10 d)及成熟種子，分析兩個GLK基因的表達模式)，結果顯示(圖2 A)，OsGLK1及OsGLK2主要在葉子及根中表達，花中少量表達，成熟種子中極少表達;不同種質間分析表明(圖2 B)，L132、L149及L160的基因表達量明顯低于對照ZH11及其他樣品，而其他樣品間差異不明顯。