摘要：【目的】明確草魚Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)信號通路基因在防御多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)感染過程中的免疫作用，為有效防控魚類多子小瓜蟲感染提供理論參考。【方法】以多子小瓜蟲感染草魚后，采用實時熒光定量PCR檢測分析在不同時間點(感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d)草魚部分TLRs基因(TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接頭蛋白基因(MyD88和TRIF)、信號轉導分子(IRAK4和IRAK1)及細胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN)在其皮膚和脾臟中的表達動態變化。【結果】草魚感染多子小瓜蟲后，TLR1、TLR2、TLR9、TLR20和TLR21基因在皮膚和脾臟中的表達主要呈上調趨勢，TLR4基因在皮膚中主要呈上調表達，在脾臟中則主要呈下調表達;TLR信號通路接頭蛋白基因MyD88和TRIF的表達變化趨勢明顯不同，其中，MyD88基因的表達在感染后第1～3 d均呈顯著上調趨勢(P<0.05，下同)，而TRIF基因的表達在整個試驗過程中絕大多數時間點與對照組無顯著差異(P>0.05);IRAK4和IRAK1在皮膚和脾臟中的表達也主要呈上調趨勢，但在脾臟中IRAK4在感染后第1 d和IRAK1在感染后第6 h的表達呈顯著下調趨勢;IL-1β和TNF-α在絕大多數時間點均顯著上調，但IFN的表達基本沒有變化。【結論】草魚TLR信號通路中的部分TLRs基因(TL1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接頭蛋白基因(MyD88)、信號轉導分子(IRAK4和IRAK1)及下游細胞因子(IL-1β和TNF-α)均參與防御多子小瓜蟲感染的免疫反應，尤其是在感染早期和中期發揮關鍵作用。

　　關鍵詞： 草魚;多子小瓜蟲;Toll樣受體(TLR);信號通路;基因表達

　　引言

　　【研究意義】Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)屬于I型跨膜蛋白，是一類重要的模式識別受體，能特異性識別病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，并通過募集接頭蛋白、轉導信號及誘導炎性細胞因子等表達而發揮免疫防御作用，既是機體的第一道天然屏障，也是連接先天性免疫和獲得性免疫的重要橋梁(何玉潔和潘建平，2017)。因此，研究TLR信號通路基因在病原感染過程中的表達動態，對揭示病原和魚類間的免疫互作機制及制定有效的防控措施具有重要意義。【前人研究進展】依據接頭蛋白的不同哺乳動物TLR信號通路可分為髓系分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)依賴型和β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR domain-containing adaptor-inducing IFN-β，TRIF)依賴型(Yuk and Jo，2011)。TLRs在識別相應的PAMPs后，除TLR3外，其他TLRs均以MyD88為接頭蛋白，然后招募白細胞介素-1受體相關激酶4(IL-1 receptor-associated kinase 4，IRAK4)和IRAK1，再將信號轉導給腫瘤壞死因子受體相關因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)，TRAF6與轉化生長因子β活化激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)及其結合蛋白(TAK1-binding proteins，TABs)TAB1和TAB2組合成復合物，從而激活下游的NF-κB和AP-1等轉錄因子，誘導免疫因子表達，最終啟動免疫防御反應(Jiménez-Dalmaroni et al.，2016)。其中，TLR2和TLR4識別細菌的脂肽和脂多糖等;TLR3識別病毒的雙鏈RNA;TLR5識別細菌的鞭毛蛋白;TLR7和TLR8識別病毒的單鏈RNA;TLR9識別非甲基化的CpG-DNA(Tan and Kagan，2017)。目前，有關TLRs與寄生蟲感染的相關性研究仍較少，僅發現TLR2或TLR4可識別利什曼原蟲(Leishmania major)(Bec-ker et al.，2003)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)(Debierre-Grockiego et al.，2007)和惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)(Zhu et al.，2011)的糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨定蛋白;TLR9可識別克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)非甲基化的DNA(Bafica et al.，2006);TLR11能識別剛地弓形蟲的Profilin-like蛋白(Yaro-vinsky et al.，2005)等。至今，已在哺乳動物中發現15種TLRs，而從魚類中至少鑒定出20種TLRs(范澤軍等，2015)。針對魚類的研究主要集中在TLRs與細菌或病毒感染的相關性方面(Liao et al.，2017)。Li等(2011a，2011b，2012，2016)研究發現，斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)的TLR2、TLR9、TLR21、MyD88及IRAK1等廣泛參與抵御刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)感染的免疫反應，表明魚類TLR信號通路基因在防御寄生蟲的感染過程中發揮重要作用。【本研究切入點】多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)是一種廣泛分布的纖毛類寄生性原蟲，幾乎可感染全部淡水魚類，引起小瓜蟲病(俗稱白點病)，導致魚類死亡或引起細菌、病毒等繼發性感染，而造成巨大的經濟損失(宋飛彪等，2012;趙飛等，2012)。草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國最重要的水產養殖魚類之一，約占淡水魚總產量的20%，但草魚養殖一直深受小瓜蟲病困擾。早期研究發現，草魚的TRAF6、TAK1、TAB1和TAB2及斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的TLR1、TLR2、TLR9和TLR21等TLR信號通路基因參與了抵御多子小瓜蟲感染的免疫應答(Zhao et al.，2013a，2013b，2014)，但草魚TLR信號通路其他基因是否參與并發揮防御多子小瓜蟲感染作用等機理尚不清楚。【擬解決的關鍵問題】以多子小瓜蟲感染草魚后通過實時熒光定量PCR檢測分析草魚的部分TLRs(TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接頭蛋白(MyD88和TRIF)、信號轉導分子(IRAK4和IRAK1)及細胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN)在其皮膚和脾臟中的表達動態變化，明確草魚TLR信號通路基因在防御多子小瓜蟲感染過程中的免疫作用，為有效防控魚類多子小瓜蟲感染提供理論參考。

　　1 材料與方法

　　1. 1 試驗材料

　　草魚購自廣東省佛山市某養殖場，健康活潑，規格整齊，體重約50 g/尾，在養殖過程中未感染過多子小瓜蟲。隨機挑取10尾草魚，鏡檢魚鰓和體表均未發現多子小瓜蟲或其他寄生蟲。草魚在實驗室內的循環流水養殖箱中暫養2周，氧氣充足，水溫控制在(23±1)℃，每日定時投喂商品飼料2次。多子小瓜蟲從患病草魚上分離獲得，采用農業農村部漁用藥物創制重點實驗室建立的以斑點叉尾鮰為宿主的室內傳代系統進行保種傳代(Zhao et al.，2013a，2013b，2014)。

　　1. 2 多子小瓜蟲幼蟲準備

　　在多子小瓜蟲傳代過程中將體表已顯現白點的斑點叉尾鮰置于5 L的塑料燒杯中，發育成熟的包囊將從魚體上自動脫落，分別用孔徑250和75 μm的網篩過濾、收集包囊。將包囊輕輕洗凈后轉入1 L的玻璃燒杯中，添加少量無菌水，23 ℃孵化20 h即發育成幼蟲，再以孔徑40 μm的網篩過濾，得到活體幼蟲濾液。取10份10 μL的幼蟲濾液，顯微鏡下觀察計數，換算出總濾液中的多子小瓜蟲活體幼蟲數量，用于后續的草魚感染試驗。

　　1. 3 感染試驗

　　將120尾草魚隨機平均分成感染組和對照組。感染組的60尾草魚置于60 L的水桶中，按1∶10000的感染劑量加入多子小瓜蟲活體幼蟲進行體表感染，感染2 h后將草魚轉至250 L的魚缸中。采用相同方法處理對照組的60尾草魚，但不添加多子小瓜蟲幼蟲。于感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d時分別從感染組和對照組隨機取樣6尾草魚。以滅菌刀片刮去草魚背部中央的鱗片，使用尖頭鑷子剝離1.0 cm×1.5 cm大小的皮膚，輕輕刮除皮膚內側肌肉以得到干凈的背部皮膚，液氮速凍后-70 ℃保存備用。同時快速采集脾臟凍存備用。

　　1. 4 總RNA提取及cDNA合成

　　采用TRIzol試劑盒(Invitrogen公司)提取草魚皮膚和脾臟組織的總RNA，以Nanodrop 1000微量紫外分光光度計(Thermo公司)和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量。使用RNase-free DNase I(Fermentas公司)去除基因組DNA后，按ReverTra Ace@ Reverse Transcriptase試劑盒(TOYOBO公司)說明反轉錄合成cDNA，反應程序：42 ℃ 20 min;99 ℃ 5 min;4 ℃ 5 min。合成的cDNA置于-20 ℃冰箱保存備用。

　　1. 5 目的基因片段克隆及測序分析

　　采用Beacon Designer 8.0設計草魚TLR信號通路基因的特異性引物(表1)。以草魚脾臟cDNA為模板進行目的基因PCR擴增，反應體系25.00 μL：cDNA模板1.00 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.00 μL，10×PCR Buffer(Mg2+)2.50 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2.00 μL，rTaq DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O 17.25 μL。擴增程序：95 ℃預變性2 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，進行35個循環;72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用E.Z.N.A? Gel Extraction Kit(OMEGA公司)進行目的條帶回收純化，然后TA克隆至pMD18-T載體上，再轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。取100.00 μL菌液凃布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB培養基上，37 ℃培養過夜，挑選3個菌落PCR驗證呈陽性的克隆送至廣州艾基生物技術有限公司測序。

　　1. 6 實時熒光定量PCR檢測分析

　　采用實時熒光定量PCR檢測感染多子小瓜蟲后草魚皮膚和脾臟組織中TLR信號通路基因的表達動態，以每個時間點各組織的cDNA為模板、β-action為內參基因，在Roche LightCycler480 Real-time PCR Detection System上進行定量檢測分析。反應體系10.00 μL：cDNA模板0.40 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.40 μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix 5.00 μL，ddH2O 3.80 μL。每個樣品均設3個重復。擴增程序：95 ℃預變性30 s;95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，進行40個循環，每個循環結束時采集1次熒光信號。采用2-△△Ct法(Livak and Schmittgen，2001)計算目的基因的相對表達量，并以SPSS 22.0進行統計分析。

　　2 結果與分析

　　2. 1 感染多子小瓜蟲后草魚TLRs基因表達的動態變化

　　2. 1. 1 TLR1和TLR2基因的表達動態 草魚感染多子小瓜蟲后，其皮膚和脾臟的TLR1和TLR2基因表達主要呈上調趨勢(表2)。在感染后第12 h，TLR1基因在皮膚中開始顯著上調表達(P<0.05，下同)，是對照組的3.02倍，至感染后第1和2 d持續上調至對照組的5.38和6.31倍;在脾臟中，TLR1基因在感染后第2和3 d時分別上調2.49和4.69倍，在其他時間點與對照組間無顯著差異(P>0.05，下同)。TLR2與TLR1基因的表達變化相似，在皮膚中表現為感染后第1～3 d均顯著上調，于感染后第3 d達峰值，為對照組的4.35倍;在脾臟中表現為感染后第2和3 d顯著高于對照組，分別是對照組的2.89和5.69倍。

　　2. 1. 2 TLR4基因的表達動態 草魚感染多子小瓜蟲后，TLR4基因在其皮膚和脾臟中的表達變化趨勢不同(表2)。在皮膚中，TLR4基因在感染后第12 h上調為對照組的2.82倍，但至感染后第1 d回落到對照組水平，隨后其表達又逐漸上調，于感染第3 d達峰值(4.55倍)。而在脾臟中，TLR4基因在感染后第12 h和第1 d的表達量顯著下調，僅為對照組的35%和25%;在其他時間點與對照組間均無顯著差異。

　　2. 1. 3 TLR9基因的表達動態 草魚感染多子小瓜蟲后，其皮膚中的TLR9基因在感染后第2、3和7 d均呈顯著上調表達，于感染后第3 d達峰值(3.35倍);而在脾臟中，TLR9基因除在感染第1 d顯著上調2.45倍和感染后第3 d顯著下調39%外，其他時間點與對照組間均無顯著差異(表2)。

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