摘 要：九香蟲 Coridius chinensis 是我國一種重要的藥食兩用昆蟲，溶菌酶是一種具有抗菌作用的糖苷水解酶。該研究從九香蟲中克隆了一種溶菌酶基因 CcLys ，其cDNA長883 bp，包含一個669 bp的開放閱讀框，編碼222個氨基酸。九香蟲溶菌酶CcLys的N-端包含一段由18個氨基酸組成的信號肽，成熟CcLys形成7個α-螺旋，8個β-折疊片的三維結構。同源性和聚類分析顯示CcLys與茶翅蝽 Halyomorpha halys 溶菌酶的親緣關系最近。基因表達譜分析表明， CcLys 在九香蟲的整個發育階段都有表達，在3齡若蟲中表達水平最高;該基因在所檢測的成蟲組織中都有表達，在脂肪體中表達水平最高。成蟲被細菌誘導后， CcLys 的表達水平在12 h達到峰值。該研究為進一步明確 CcLys 基因的功能及開發新型抗菌藥物奠定基礎。

　　關鍵詞：九香蟲;溶菌酶;糖苷水解酶;基因表達模式

　　《致富之友》農村經營管理刊物。宣傳黨和政府關于農村工作的政策法令，傳播經濟技術知識、信息，服務于家庭經營單位、鄉鎮企業、及其它各類合作經濟組織。

　　昆蟲在外界因素(細菌、真菌等病原體)刺激下激活體內的先天性免疫途徑，產生抗菌肽等體液免疫因子，有效地抵御病原體的侵染[1]。溶菌酶是參與這種保護機制的重要分子之一。溶菌酶(lysozyme)是一個龐大而多樣的肽聚糖水解酶家族，又稱胞壁質酶(muramidase)，廣泛存在于自然界，具有抗菌、消炎、抗病毒和消化等多種作用[2-3]，具有生物相容性好、對組織無刺激無毒性的特點，已被作為一種殺傷病原微生物而不破壞機體的優質酶制劑。溶菌酶化學性質穩定，商品化產品主要來自于蛋清溶菌酶，僅對革蘭氏陽性菌有抑制作用，為此國內外科研人員一直致力于開發新型溶菌酶;更多溶菌酶的不斷發現和對該酶的深入研究，使其在商業和醫療應用顯現出巨大的潛力和價值[4-5]。

　　根據其分子結構和來源的不同，溶菌酶分為6類：C型(雞型溶菌酶)、G型(鵝型溶菌酶)、I型(無脊椎動物型溶菌酶)、噬菌體型、細菌型和植物型[6]。從后生動物中已經鑒定出C、G和I型三種溶菌酶，它們都能水解細菌細胞壁肽聚糖N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid，NAM)和N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine，NAG)之間的β-1，4-糖苷鍵[7]。動物性溶菌酶分布廣泛，主要存在于動物的免疫器官、免疫細胞、消化系統以及高等動物的分泌物中。C型溶菌酶是截止目前被眾多學者研究得最多和最深入的類型，該類溶菌酶大多都來自于昆蟲以及脊椎動物[8]。不同種類的溶菌酶蛋白的氨基酸排列不同，但是都具有保守的酶活性位點，發揮水解功能;C型溶菌酶的活性中心含有必需基因Asp和Glu[9]。

　　九香蟲 Coridius chinensis 是我國重要的藥用昆蟲，隸屬于昆蟲綱半翅目蝽科瓜蝽屬，具有理氣止痛、溫中助陽之功能[10-11]。九香蟲是一種藥食兩用昆蟲，在全國大部分地區均有分布，具有極大的開發利用價值[12-13]。該蟲在自然界中很少發生被病原微生物感染而導致死亡的情況，這要歸功于它的先天免疫系統。體外實驗表明，九香蟲對金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌和福氏痢疾桿菌具有很強的抗菌作用[14]。吳瑪莉等[15]用凝膠過濾法從九香蟲血淋巴的上清液中分離提純獲得一種1-14.4 kDa的抑菌小分子肽，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有抑制作用。李尚偉等[16]對九香蟲血淋巴進行質譜分析得到了10條短肽，并對其中一條短肽進行了抗菌活性研究，結果表明該肽對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有明顯的抑菌作用。本研究用反轉錄PCR(reverse-transcription PCR，RT-PCR)從九香蟲中克隆了溶菌酶基因，命名為 CcLys ，并對其進行特征分析，為進一步研究該基因的功能、開發新型的抗菌藥物及九香蟲資源的開發利用奠定基礎。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗昆蟲和樣品收集

　　對采自野外的九香蟲成蟲在貴州大學昆蟲研究所進行室內飼養，溫度為(25±1)℃，相對溫度70%左右，光周期14L∶10D。收集卵、1～5齡若蟲、成蟲以及成蟲的不同組織(頭部、肌肉、體壁、脂肪體、睪丸和卵巢)樣本，置于RNAlater(Qiagen，Duesseldorf，Germany)中在-20℃條件下保存備用。

　　1.2 主要試劑和儀器

　　HP TotalRNA Kit 購于美國 Omega Bio-Tek 公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和2× SYBR Select Master Mix購于美國Thermo Fisher科技有限公司;大腸桿菌 Escherichia coli TOP10 感受態細胞、DL2000 DNA marker和PrimeScript RT-PCR Kit均購于大連TaKaRa公司;T100 Thermal Cycler 和C1000 Thermal Cycler購于美國Bio-Rad公司;其他常規試劑與耗材均購自于生工生物工程(上海)股份有限公司。

　　1.3 總RNA提取和cDNA合成

　　使用HP Total RNA Kit(Omega Bio-Tek，GA，USA)提取4齡若蟲總RNA，操作步驟按照試劑盒說明書進行。RNA的純度和質量分別用NanoDrop 2000紫外分光光度計(Thermo Fisher，MA，USA)和1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。以提取的九香蟲總RNA為模板，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher，MA，USA)反轉錄合成cDNA，根據說明書進行操作。

　　1.4 九香蟲溶菌酶基因克隆

　　根據九香蟲全長轉錄組數據中注釋的溶菌酶基因序列，用Primer Premier 6.0設計PCR引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)。在T100 Thermal Cycler(Bio-Rad，CA，USA)上進行反轉錄PCR(RT-PCR)。PCR反應體系為50 μL：25 μL 2× TsingKe Master Mix(北京擎科生物公司)，2 μL cDNA模板，上、下游引物(10 μM)各1 μL，補加21 μL滅菌超純水。 反應條件： 94℃預變性3 min;94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，共進行30個循環;72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程(上海)有限公司進行測序，測得的序列用BLAST在NCBI的Nr蛋白數據庫中進行比對。

　　1.5 生物信息學分析

　　CcLys 基因的編碼區用NCBI ORF Finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進行預測，用ProtParam(https：//web.expasy.org/protparam/)對編碼的蛋白質進行分子量和等電點預測。采用SignalP 4.1 Server(http：www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析預測信號肽，用NetOGlyc 4.0 Server (http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)和NetNGlyc 1.0 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預測糖基化位，用KinasePhos(http：//kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/)預測磷酸化位點。用MEGA-X和GeneDoc 2.7將CcLys氨基酸序列與其他11種來自昆蟲和細菌的溶菌酶氨基酸序列進行對齊分析;使用MEGA-X進行聚類分析。用于多序列對齊和聚類分析的溶菌酶來源物種及GenBank登錄號列于表2中。使用 SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)的同源建模方法預測成熟CcLys酶蛋白的三維結構，用PyMOL 1.4繪制其分子結構圖。

　　1.6 基因表達譜分析

　　用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)分析在九香蟲不同發育時期、成蟲的不同組織及成蟲免疫后不同時間溶菌酶 CcLys 基因的表達模式。用金黃色葡萄球菌( Staphylocous aureus )和大腸桿菌( E. coli )的等量混合物分別對20只健康的成蟲進行腹部注射，分別在3、6、12、24、36和48 h收集存活的成蟲樣品。提取這些樣品的總RNA，反轉錄成cDNA，然后在C1000 Thermal Cycler(Bio-Rad，CA，USA)上進行RT-qPCR。反應體系為20 μL：1 μL cDNA模板，上、下游引物(20 mM)各1 μL，10 μL 2× SYBR Select Master Mix(Thermo Fisher，MA，USA)，補加7 μL 無RNA酶的滅菌超純水。反應條件：50℃，2 min;95℃，2 min;95℃變性15，58℃退火15，72℃延伸1 min，共40個循環。用九香蟲 β-actin 基因(GenBank登錄號：MK370101)作內參對照，相關的引物列于表1。用2 -ΔΔCt方法分析 CcLys 的mRNA表達水平，每個樣本進行3次重復實驗。

　　1.7 數據統計與分析

　　數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 22統計軟件方差分析(ANOVA)的鄧肯氏新復極差法(Duncan’s test)進行多重檢驗，顯著性檢驗水平為 P < 0.05。

　　2 結果與分析

　　2.1 CcLys 的cDNA克隆

　　以4齡若蟲總RNA為模板經RT-PCR擴增得到九香蟲溶菌酶基因 CcLys 的cDNA(GenBank登錄號：MK526903)。該cDNA長883 bp，包含一個長669 核苷酸(nt)的開放閱讀框，編碼222個氨基酸;5端有66 nt的非編碼區(UTR)，3端有148 nt的UTR。該溶菌酶CcLys的N端具有一段由18個氨基酸組成的信號肽(圖1)。

　　2.2 CcLys特征分析

　　CcLys酶蛋白的分子式為C1121H1718N310O331S7，分子量為25.06 kDa，理論等電點為7.7。該酶蛋白在N209具有N-糖基化位點，無O-糖基化位點，有7個磷酸化位點(S16、T52、Y57、T67、S167、S168和S211)。BLAST分析表明，CcLys含有糖基水解酶25家族(GH25)催化結構域。同源建模分析顯示，成熟CcLys的三維分子結構包括7個α-螺旋，8個β-折疊片，15個無規卷曲(圖2)。

　　2.3 同源性比較與聚類樹

　　將CcLys氨基酸序列在NCBI的蛋白質數據庫中進行比對，結果顯示該溶菌酶與茶翅蝽、點蜂緣蝽和擬果蠅沃爾巴克氏內共生菌的溶菌酶氨基酸序列分別具有61%、52%和52%的相似性。CcLys氨基酸序列與來自于7種昆蟲和4種細菌的溶菌酶氨基酸進行對齊，結果顯示他們都具有保守的谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)和色氨酸(W)，這3種氨基酸是溶菌酶活性中心的必需基團;具有DXE保守序列(圖3)。系統進化樹顯示，CcLys與茶翅蝽溶菌酶首先聚為一支，再與點蜂緣蝽溶菌酶聚為一支;棉蚜與豌豆蚜的溶菌酶聚為一支;3種螞蟻溶菌酶聚為一支，再與擬果蠅沃爾巴克氏內共生菌的溶菌酶聚為一支;來自煙粉虱和潮蟲的沃爾巴克氏內共生菌溶菌酶聚為一支(圖4)。同源性比較和聚類分析表明，九香蟲溶菌酶與茶翅蝽溶菌酶的親緣關系最近。

　　2.4 CcLys 基因表達模式

　　RT-qPCR分析顯示， CcLys 在九香蟲的所有發育17階段都有表達，在若蟲期的表達水平較高，在成蟲的表達水平次之，在卵中的表達水平最低;在3齡若蟲中的表達水平最高，是成蟲的33倍、卵的395倍(圖5)。該基因在所檢測的成蟲組織中都有表達，在脂肪體中的表達水平最高，在肌肉中的

　　表達最低;表達水平從高到低的組織依次是：脂肪體>卵巢>精巢>頭部>體壁>肌肉，在脂肪體中的表達水平是在肌肉中的39304倍(圖6)。九香蟲成蟲在被大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合菌液刺激后， CcLys 表達先下調然后上調，在12 h達到峰值，之后又下降;在36 h和48 h表達水平沒有變化。 CcLys 基因在誘導后12 h的表達水平是誘導前的2455倍，是誘導后3 h的9676倍(圖7)。

　　3 結論與討論

　　溶菌酶是一種抗菌酶，是昆蟲先天免疫系統的一部分。它是一種糖苷水解酶，水解兩種或多種碳水化合物之間或碳水化合物和非碳水化合物之間的糖苷鍵。基于序列相似性的糖基水解酶分類系統已經定義了85個不同的家族[17]。糖苷水解酶第25 家族(GH25)僅包含一種具有已知活性的酶，該酶主要水解肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖殘基間及殼聚糖中N-乙酰-D-氨基葡萄糖殘基間的β-1，4-糖苷鍵。許多細胞壁裂解酶是共同進化的，可以歸為一個家族[18-19]。Glu和Asp兩個殘基對溶菌酶的催化活性極其重要，這些殘基以及它們附近的一些其他殘基在這個家族的所有蛋白質成員中都是保守的[20]。GH25家族溶菌酶都含有一段DXE保守序列，該功能域負責識別和切斷β-l，4-糖苷鍵。CcLys含有GH25家族溶菌酶高度保守的Glu和Asp這兩個必需基團，且都位于DXE基序之中，這對于九香蟲溶菌酶發揮催化功能具有重要作用。

　　Martinez-Fleites等[21]通過研究炭疽桿菌的GH25溶菌酶的結構，發現這個家族的溶菌酶采用類似于桶狀折疊片層的(α/β)5(β)3二級結構。GH25溶菌酶的活性中心與同屬糖苷水解酶家族的GH18、GH20、GH56、GH84和GH85的活性中心極其相似，這意味著GH25溶菌酶很可能保留這一“超級家族”常見的異頭物構型，并使用相同的鄰位催化機制。Korczynska等[22]測定了煙曲霉中GH25溶菌酶的X射線結構，第一次研究真菌中GH家族溶菌酶的結構，改進了α/β桶狀折疊片層模型，8個β-折疊桶兩側圍繞3個α-螺旋。活性位點位于這個模型帶負電的口袋底部，其構型與GH25和相關GH家族的其他成員已揭示的結構有很多相似之處。這些研究證實了糖苷水解酶家族通過“酶催化物輔助”催化機制起作用的觀點[23-24]。預測的成熟CcLys的三級結構由8個β-折疊片層形成桶狀構型，7個α-螺旋圍繞在桶周圍，與GH25溶菌酶具有類似的結構。