摘要：以玉針香/鄂中5號(hào)/玉晶91為材料，探討水稻(Oryza sativa L.)花藥培養(yǎng)過(guò)程對(duì)培養(yǎng)效果的影響。結(jié)果表明，以蔗糖為碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)，低溫預(yù)處理8 d效果較好，以麥芽糖為碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)則預(yù)處理10 d達(dá)到最好的誘導(dǎo)效果，但總體以麥芽糖為碳源誘導(dǎo)明顯好于以蔗糖為碳源誘導(dǎo);早取穗和晚取穗都不利于愈傷組織的誘導(dǎo);以麥芽糖做碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織分化效果較好，分化率較高;同一批材料中，較早誘導(dǎo)出的愈傷組織分化率遠(yuǎn)高于后期長(zhǎng)出的愈傷組織。

　　關(guān)鍵詞：水稻(Oryza sativa L.);花藥培養(yǎng);誘導(dǎo)率;分化率

　　單倍體植株，1975 年中國(guó)利用花藥培養(yǎng)育種技術(shù)第1次育成了粳稻品種單豐1 號(hào)，標(biāo)志花培技術(shù)在中國(guó)常規(guī)水稻育種中開(kāi)始應(yīng)用。由于花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體，表現(xiàn)出雙親性狀的各種重組類型，通過(guò)自然加倍或人工處理加倍，可以在當(dāng)代獲得穩(wěn)定的純合二倍體。將花藥培養(yǎng)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，可以快速純合有益基因，提高選擇效率，縮短育種周期[1-6]。截至目前，水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)逐步完善，并應(yīng)用于水稻遺傳育種，并成為當(dāng)今生物技術(shù)育種中較為成熟、實(shí)用、有效的育種新技術(shù)。

　　各開(kāi)展水稻相關(guān)基礎(chǔ)研究的科研單位也由于研究工作的需要，希望能快速得到較大的DH群體或穩(wěn)定的水稻材料，也很大程度依賴于花藥培養(yǎng)技術(shù)。在實(shí)際操作過(guò)程中，由于受材料的差異性、培養(yǎng)基組分以及培養(yǎng)操作過(guò)程等的影響，往往獲得的再生植株群體較小，使育種選擇受到較大的限制或影響后續(xù)研究。因此，提高花藥培養(yǎng)的效率，增大花培后代群體，是水稻花培研究人員共同的目標(biāo)。

　　水稻花培技術(shù)已經(jīng)有幾十年的歷史，但大多數(shù)都是針對(duì)粳稻，因此粳稻的花藥培養(yǎng)已經(jīng)相對(duì)比較成熟，而秈稻的花培效率一直較低，嚴(yán)重影響秈稻花培育種的進(jìn)程。關(guān)于如何提高花藥培養(yǎng)的效率，國(guó)內(nèi)外也有很多的文獻(xiàn)報(bào)道，在基本培養(yǎng)基成分、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和配比、低溫預(yù)處理等對(duì)培養(yǎng)效率的影響方面進(jìn)行了大量的研究，但培養(yǎng)過(guò)程中包括取穗時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)的影響、誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)分化的影響分化接種階段對(duì)分化的影響等研究較少。本試驗(yàn)通過(guò)秈稻材料花培過(guò)程中不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件下取穗時(shí)期、取穗后預(yù)處理時(shí)間、分化接種時(shí)間等對(duì)花藥培養(yǎng)效果的影響，通過(guò)統(tǒng)計(jì)不同條件下愈傷組織誘導(dǎo)率或分化率，得到秈稻花藥培養(yǎng)較好的培養(yǎng)條件，為廣大花培工作者提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 植物材料 所用水稻材料為中稻秈型育種材料玉針香/鄂中五號(hào)/玉晶91。

　　1.1.2 培養(yǎng)基 以N6為誘導(dǎo)培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基;以MS為分化培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基;培養(yǎng)基中所用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和脯氨酸濃度單位為mg/L;培養(yǎng)基的pH均為5.8。

　　1.2 方法

　　1.2.1 幼穗取材及低溫預(yù)處理 幼穗取材一般于晴天上午10：00前或下午5：00后進(jìn)行。選取劍葉與下一葉的葉枕距約8 cm的帶苞葉稻穗，此時(shí)幼穗的穎殼寬度已接近成熟的大小，穎殼呈現(xiàn)淡綠色，雄蕊伸長(zhǎng)達(dá)穎殼的1/3～1/2，花藥發(fā)育處于單核中晚期。將帶苞葉稻穗用濕潤(rùn)紗布包裹，裝入保鮮袋后置于冰箱中8 ℃進(jìn)行低溫預(yù)處理8～10 d。

　　1.2.2 花藥接種 無(wú)菌臺(tái)上剝除稻穗苞葉，選取合適的小穗剪下，用新配制的3%次氯酸鈉溶液浸泡23 min，用無(wú)菌水沖洗4～5次，用無(wú)菌濾紙吸干水后，采用剪穎抖藥法將花藥接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)三角瓶約接種100個(gè)花藥。

　　1.2.3 培養(yǎng)條件 誘導(dǎo)階段均采取28 ℃黑暗培養(yǎng)。

　　1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法 隨機(jī)抽取每種試驗(yàn)類型誘導(dǎo)的材料10瓶，統(tǒng)計(jì)每瓶的誘導(dǎo)率，計(jì)算平均值得出該試驗(yàn)類型的愈傷組織誘導(dǎo)率;不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)后的分化率則為隨機(jī)抽取每種試驗(yàn)類型的分化材料10瓶統(tǒng)計(jì)分化情況，計(jì)算平均值。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 取穗時(shí)期對(duì)誘導(dǎo)效率的影響

　　采用兩種不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基研究取穗時(shí)期對(duì)誘導(dǎo)的影響，具體結(jié)果見(jiàn)表2。2月28日和3月4日取穗低溫處理后，不論是I3還是I7培養(yǎng)基，平均誘導(dǎo)率都低于3月1日和3月3日取穗的誘導(dǎo)率。也就是說(shuō)過(guò)早和過(guò)晚取穗誘導(dǎo)效果都會(huì)變差。I7誘導(dǎo)率明顯高于I3，最高可比I3提高49%。

　　2.2 預(yù)處理時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)效率的影響

　　通過(guò)兩種不同成分的誘導(dǎo)培養(yǎng)基來(lái)探討低溫預(yù)處理時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)率的影響。研究結(jié)果如表3所示，不同成分的培養(yǎng)基對(duì)預(yù)處理時(shí)間的要求不同。以I3誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，8 ℃條件下預(yù)處理8 d達(dá)到最高誘導(dǎo)率13.53%;以I7誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，則預(yù)處理10 d效果最好，達(dá)到23.12%，是I3誘導(dǎo)時(shí)最高誘導(dǎo)率的1.7倍。

　　2.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)分化的影響

　　采用兩種不同培養(yǎng)基I3和I7，愈傷組織接種到相同分培養(yǎng)基F1上進(jìn)行分化。從表4可以看出，I7誘導(dǎo)出的愈傷組織具有較高的綠苗分化率，分化效果較好。

　　2.4 分化接種時(shí)間對(duì)分化的影響

　　不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織根據(jù)愈傷形成的先后分批接種到分化培養(yǎng)基上。從表4可以看出，最先形成的愈傷組織具有較好的胚性和分化能力，能分化出完整的花培綠色植株。隨著時(shí)間推移，較晚形成的愈傷組織分化能力迅速下降，產(chǎn)生綠苗的能力迅速降低。

　　3 討論

　　典型秈稻花藥培養(yǎng)一直被認(rèn)為是各種水稻類型中培養(yǎng)效果最差的[17，18]，探討花藥培養(yǎng)條件的各種文獻(xiàn)報(bào)道也不少。由于水稻花藥培養(yǎng)受基因型的影響太大，因此，很難得出統(tǒng)一的培養(yǎng)培養(yǎng)條件。本研究以玉針香/鄂中5號(hào)/玉晶91為研究材料，探討水稻花藥培養(yǎng)過(guò)程對(duì)培養(yǎng)效果的影響。結(jié)果表明，以蔗糖為碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)，低溫預(yù)處理8 d效果較好，以麥芽糖為碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)則預(yù)處理10 d達(dá)到最好的誘導(dǎo)效果，但總體以麥芽糖為碳源誘導(dǎo)明顯好于以蔗糖為碳源誘導(dǎo);早取穗和晚取穗都不利于愈傷組織的誘導(dǎo);以麥芽糖做碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織分化效果較好，分化率較高;同一批材料中，較早誘導(dǎo)出的愈傷組織分化率遠(yuǎn)高于后期長(zhǎng)出的愈傷組織。

　　在水稻尤其是秈稻的花藥培養(yǎng)中，有很多文獻(xiàn)報(bào)道誘導(dǎo)階段使用麥芽糖作為碳源有較好的效果[6，7，19]。本研究也得出相同的結(jié)論，即秈稻花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)階段麥芽糖效果明顯好于蔗糖。同時(shí)，麥芽糖作為碳源誘導(dǎo)出的愈傷組織具有較好的分化效果。1998年，丁世萍等[20]分析組織培養(yǎng)過(guò)程中麥芽糖作碳源優(yōu)于蔗糖的可能原因：作為營(yíng)養(yǎng)物，麥芽糖可在麥芽糖酶作用下分解為葡萄糖，也可在麥芽糖磷酸化酶作用下分解為葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸;蔗糖分解為葡萄糖和果糖，果糖可能對(duì)培養(yǎng)物有害。

　　從偏秈材料的低溫預(yù)處理來(lái)看，9 ℃處理7～10 d有利于提高花藥愈傷組織誘導(dǎo)頻率[21]，少有研究針對(duì)不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基探討低溫預(yù)處理時(shí)間。本研究則發(fā)現(xiàn)8 ℃條件下，如果使用I3培養(yǎng)基即用蔗糖作為碳源誘導(dǎo)愈傷組織，處理8 d能達(dá)到最高的誘導(dǎo)率，而如果選用I7培養(yǎng)基即用蔗糖作為碳源誘導(dǎo)愈傷組織，處理10 d能達(dá)到最高的誘導(dǎo)率。這可能與麥芽糖有較好的調(diào)節(jié)滲透壓作用有關(guān)。

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1] 朱旭東，曾大力，斯華敏，等.標(biāo)記兩用核不育水稻M2S的花藥培養(yǎng)及遺傳分析[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2002，16(2)：24-128.

　　[2] 曾千春，吳 茜，馮德江，等.轉(zhuǎn)修飾cry1Ac基因秈稻明恢81經(jīng)花藥培養(yǎng)獲得抗蟲(chóng)DH系[J].生物工程學(xué)報(bào)，2002，18(4)：442-445.

　　[3] 黃翠紅，楊瑰麗，黃 明，等.兩系不育系Y58S的花藥培養(yǎng)與花培后代的鑒定篩選[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43(5)：31-36.

　　[4] 葛勝娟.水稻花藥培養(yǎng)及其在遺傳育種上的應(yīng)用[J].種子，2013， 32(8)：45-50.

　　[5] 葛勝娟.水稻花藥培養(yǎng)及其在遺傳育種上的應(yīng)用[J].種子，2013， 32(9)：47-50.

　　[6] 李三和，陳志軍，劉 凱，等.秈稻不育系花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)條件探討[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54(19)：4868-4870.

　　[7] 孫宗修，斯華敏，程式華.麥芽糖提高水稻花培效率的研究[J].中國(guó)水稻科學(xué)，1993，7(4)：227-231.

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