摘要：柑橘(Citrus reticulata Blanco)屬蕓香科下屬植物。性喜溫暖濕潤(rùn)氣候，耐寒性較柚、酸橙、甜橙稍強(qiáng)。蕓香科柑橘亞科分布在北緯16°~37°之間。是熱帶、亞熱帶常綠果樹(除枳以外)，用作經(jīng)濟(jì)栽培的有3個(gè)屬：枳屬、柑橘屬和金柑屬。中國(guó)和世界其他國(guó)家栽培的柑橘主要是柑橘屬。

　　關(guān)鍵詞：柑橘,科學(xué)種植,農(nóng)業(yè)科技論文

　　柑橘的組成由：根、莖、葉、花和果實(shí)組成。小喬木。單身復(fù)葉，翼葉通常狹窄，或僅有痕跡，葉片披針形，橢圓形或闊卵形，大小變異較大，頂端常有凹口，中脈由基部至凹口附近成叉狀分枝，葉緣至少上半段通常有鈍或圓裂齒，很少全緣?；▎紊?-3朵簇生;花萼不規(guī)則5-3淺裂;花瓣通常長(zhǎng)1.5厘米以內(nèi);雄蕊20-25枚，花柱細(xì)長(zhǎng)，柱頭頭狀。葉柑橘的葉片為常綠性的單生復(fù)葉，由葉身、葉翼組成。葉翼著生在葉柄上。柑橘種類品種不同，葉的大小不等，形狀各異。[5] 根由主根、側(cè)根、須根及須根端著生極短的根毛構(gòu)成的群體，統(tǒng)稱為根系。壓條或繁殖的植株，無(wú)主根。樹干與根交界處，叫根頸。[5] 枝干柑橘枝干由主干、主枝、側(cè)枝組成。

　　果形種，通常扁圓形至近圓球形，果皮甚薄而光滑，或厚而粗糙，淡黃色，朱紅色或深紅色，甚易或稍易剝離，橘絡(luò)甚多或較少，呈網(wǎng)狀，易分離，通常柔嫩，中心柱大而?？?，稀充實(shí)，瓢囊7-14瓣，稀較多，囊壁薄或略厚，柔嫩或頗韌，汁胞通常紡錘形，短而膨大，稀細(xì)長(zhǎng)，果肉酸或甜，或有苦味，或另有特異氣味;種子或多或少數(shù)，稀無(wú)籽，通常卵形，頂部狹尖，基部渾圓，子葉深綠、淡綠或間有近于乳白色，合點(diǎn)紫色，多胚，少有單胚?；ㄆ?-5月，果期10-12月。[6]

　　研究背景

　　柑橘是世界第一大水果。目前對(duì)柑橘生產(chǎn)危害最為嚴(yán)重的病害有黃龍病、潰瘍病、衰退病等(Gmitter et al., 2012)采用藥劑防治雖然也有一定的效果，但勢(shì)必造成環(huán)境污染，而且易導(dǎo)致食品安全問題;持續(xù)用藥，病原物可能會(huì)產(chǎn)抗藥性(Behlau et al., 2011)，從而會(huì)加大防治難度。噴施農(nóng)藥雖然有一定的功效，但長(zhǎng)期噴施容易帶來(lái)3R (Residue, Resistance, Resurgence)問題。因此抗病育種成為柑橘育種的重要目標(biāo)之一。如果成功分離和克隆R基因，直接在基因水平上開展基因工程育種，就能有效加快抗病育種進(jìn)程。植物抗病基因(Resistance gene,R基因)的克隆與分析已經(jīng)成為植物抗病育種的研究熱點(diǎn)。1992年玉米抗圓斑病基因Hml被克隆，這是世界上第一個(gè)被克隆的R基因(Johal and Briggs, 1992)。之后有學(xué)者發(fā)現(xiàn)R基因的序列同源性較高，編碼的蛋白質(zhì)具有相似的結(jié)構(gòu)域(Ellis et al., 1995; Song et al., 1995; Lawrence et al., 1995; Grant et al., 1995; Zhou et al., 1995; Hammond-Kosack and Kanyuka, 2007)。Kanazin等(1996)利用R基因產(chǎn)物的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物對(duì)植物DNA進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物與R基因同源性較高，將其稱之為resistance gene analog (RGA)，中譯為抗病基因同源序列。也有學(xué)者將稱之為resi- stance gene homologue (RGH, Brotman et al., 2002)，resistance gene candidate (RGC, Shen et al., 1998)，resistance gene-like sequence (RGL, Vicente and King, 2001)，分別中譯為抗病基因類似物、抗病候選基因、類抗病基因序列。其中抗病基因同源序列(RGA)被廣泛使用。RGA是一類結(jié)構(gòu)上與R基因類似的序列。有的RGA與R基因緊密連鎖，有的RGA本身即是R基因。根據(jù)RGA的上述特點(diǎn)，RGA在以下幾個(gè)方面得到了應(yīng)用：作為一種分子標(biāo)記，用于標(biāo)記抗病基因(丁國(guó)華, 2004)，構(gòu)建遺傳圖譜(Bakker et al., 2011; Niu et al., 2011)、分子標(biāo)記輔助育種(Silva et al., 2012)以及種質(zhì)資源分析(肖天霞, 2006);將RGA作為探針，篩選基因組文庫(kù)克隆抗病基因(Feuilet et al., 1997)。目前克隆RGA有兩種方法：PCR擴(kuò)增得到RGA，數(shù)據(jù)庫(kù)檢索法預(yù)測(cè)RGA (張禮鳳等, 2009; 任鄄勝, 2008; 尚世界, 2009; Rossi et al., 2003)。柑橘RGA研究亦有所開展。本文將對(duì)柑橘RGA的研究進(jìn)展作一綜述，并對(duì)柑橘RGA的應(yīng)用進(jìn)行了探討。

　　1、PCR擴(kuò)增得到柑橘RGA

　　目前，獲得柑橘RGA多采用PCR擴(kuò)增的方法。

　　PCR擴(kuò)增的方法有兩種類型：一種是根據(jù)R基因編碼的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到RGA;另一種是根據(jù)R基因保守序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到有表達(dá)信息的RGA。對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增獲得RGA是比較常用的方法。Deng等(2000)根據(jù)NBS類抗病基因產(chǎn)物的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)6條簡(jiǎn)并引物，構(gòu)建4個(gè)引物組合，對(duì)柑桔屬和枳屬的屬間雜種“USDA17-47”的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析表明，22條序列屬于NBS-LRR類R基因超家族，并開發(fā)了與柑橘衰退病和根結(jié)線蟲有關(guān)的CAPS標(biāo)記。Deng等(2003)以“USDA17-47”為試材，根據(jù)水稻白葉枯病抗性基因Xa21和番茄青枯病抗性基因Pto編碼的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)2條簡(jiǎn)并引物，最終克隆獲得29條柑橘蛋白激酶類RGA，且明確了各序列以1~3個(gè)拷貝形式存在基因組中，利用引物步行法獲得2個(gè)序列的全長(zhǎng)，具備Xa21蛋白的全部特征。安然(2010)根據(jù)細(xì)菌斑點(diǎn)病基因prf和擬南芥霜霉病基因RPM1編碼的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域NBS-LRR設(shè)計(jì)2條簡(jiǎn)并引物，對(duì)構(gòu)櫞、貞橙、三葉、椮橙、宜昌橙25-86、冰糖橙6個(gè)柑橘品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了9個(gè)RGA。對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增獲得RGA的研究較少。諶謀華(2003)根據(jù)已知抗病設(shè)計(jì)了8條引物，組成15對(duì)引物，對(duì)枳殼、九里香、黃皮、國(guó)慶1號(hào)的基因組DNA及枳殼、九里香、國(guó)慶1號(hào)的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了25個(gè)RGA，并以其中的RGAn-17-2作探針，對(duì)柑橘基因組DNA進(jìn)行RFLP分析，RGAn-17-2在枳殼、九里香、黃皮、國(guó)慶1號(hào)中都有若干同源片段。黃代青等(2004)提取琯溪蜜柚花柱的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄合成其cDNA，根據(jù)R基因編碼的蛋白質(zhì)NBS保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)2條簡(jiǎn)并引物，對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大小約為500 bp的PCR產(chǎn)物，對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行酶切歸類，篩選得到不同類別的克隆12個(gè)，并進(jìn)行了測(cè)序。通過序列同源比較分析發(fā)現(xiàn)，其中有10個(gè)片段屬于NBS-LRR 類RGA，與已知植物R基因相應(yīng)區(qū)段的氨基酸序列的同源性為11.5%~47.1%。

　　目前,幾乎所有已知柑橘RGA都是通過PCR擴(kuò)增的方法獲得。這種方法對(duì)沒有全基因序列且基因組龐大的物種來(lái)說(shuō)比較適宜，但不足之處是不能覆蓋全基因組的RGAs。急需采用新的方法滿足柑橘RGA研究的需要。

　　2、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索法預(yù)測(cè)柑橘RGA

　　隨著基因組學(xué)及生物信息學(xué)的發(fā)展，許多植物的EST序列相繼公布，并且一些物種基因組測(cè)序已經(jīng)完成，發(fā)展了數(shù)據(jù)庫(kù)檢索(data mining)的方法，即從EST或基因組測(cè)序中利用生物信息學(xué)手段尋找RGAs，可以獲得該物種全基因組的表達(dá)RGA。該方法簡(jiǎn)單快速，信息量大，是預(yù)測(cè)R基因的有效方法，已在大豆(張禮鳳等, 2009)、甘蔗(Rossi et al., 2003)、小麥(Dilbirligi and Gill, 2003)、玉米(Xiao et al., 2006)、水稻(肖天霞, 2006; Wang et al., 2005)等作物上成功應(yīng)用。目前在柑橘上尚未見利用數(shù)據(jù)庫(kù)檢索法獲得RGA的報(bào)道。柑橘的基因組較小，基因組測(cè)序已經(jīng)完成。若用數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的方法在全基因組水平上克隆柑橘RGAs將提供一個(gè)通過RGA途徑高效克隆柑橘R基因的技術(shù)平臺(tái)，會(huì)大大加快柑橘抗病基因研究的進(jìn)程。

　　3、柑橘RGA的應(yīng)用

　　Yang等(2001)根據(jù)NBS保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物，對(duì)枳殼BAC文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增和酶切，獲得了一個(gè)1.2 mol的重疊群，其中包含了柑橘衰退病抗性基因座。這個(gè)基因座的幾個(gè)預(yù)測(cè)抗性基因與水稻Xa21基因，番茄Cf-2基因以及擬南芥RPS2基因相似，可用于標(biāo)記抗病基因。向旭等(2005)對(duì)從柑桔與枳屬間雜種的基因組DNA 所獲得的RLK-RGA，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，對(duì)柑桔抗?jié)儾〔牧虾透胁〔牧线M(jìn)行分析，獲得了一個(gè)與柑 橘 潰 瘍 病 相 關(guān) 的 特 異 性 更 強(qiáng) 的 抗 性 標(biāo) 記 -19h16/Dde1標(biāo)記位點(diǎn)，可用于分子標(biāo)記輔助育種。Songwattana (2010)利用12對(duì)NBS-LRR RGA序列(Deng et al., 2000)作引物結(jié)合限制性酶切對(duì)泰國(guó)萊檬雜種m33以及父母本Pan and Nam Hom的抗性基因進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明標(biāo)記Pt9/Alu1、Pt14/ Bfa1、16R1-19/Tru1I與M33和Nam Hom lime的抗性基因緊密連鎖;Pt9和16R1-19的蛋白質(zhì)分析表明其屬于non-TIR-NBS-LRR亞家族，Pt14屬于TIR- NBS-LRR亞家族。向旭等(2009)利用3個(gè)與柑橘根結(jié)線蟲連鎖的NBS-LRR RGA序列(Deng et al., 2000)作標(biāo)記，對(duì)柑屬和枳屬的屬間雜種“USDA17-47”進(jìn)行擴(kuò)增并酶切，獲得了一個(gè)柑橘根結(jié)線蟲抗性標(biāo)記。Gulsen等(2010)利用2個(gè)RGA標(biāo)記(Deng et al.,2000)結(jié)合SRAP、SSR、ISSR、POGP、RGA及 RAPD標(biāo)記建立了一個(gè)柑橘連鎖圖譜。上述柑橘RGA的應(yīng)用多集中于抗性標(biāo)記方面。利用柑橘RGA克隆抗病基因尚未見報(bào)道。

　　4、展望

　　基于RGA克隆抗病基因已經(jīng)得到共識(shí)。但利用RGA進(jìn)行抗病基因克隆也存在一些問題：抗病基因編碼的蛋白質(zhì)由于密碼子的簡(jiǎn)并性，根據(jù)抗病基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物特異性不足;同源序列同源性不一，也使得引物設(shè)計(jì)有偏差;抗病基因多成簇存在，克隆得到的RGA不一定是目的片段。已有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)，如用高分辨率的PAGE膠代替瓊脂糖電泳，提高擴(kuò)增產(chǎn)物的分辨效率(Rivkin et al., 1999)。也可直接將RGA轉(zhuǎn)入柑橘植株，觀察轉(zhuǎn)基因植株的表現(xiàn)，進(jìn)而分析RGA的功能，或者根據(jù)RGA序列設(shè)計(jì)特異性引物，轉(zhuǎn)換為CAPS標(biāo)記，可用于分子標(biāo)記輔助育種。與水稻、小麥等作物相比，柑橘RGA的研究較為薄弱，對(duì)其利用也研究較少。柑橘基因組測(cè)序的完成為在全基因組水平上大規(guī)模挖掘RGA提供了新契機(jī)。在后基因組時(shí)代，柑橘RGA將會(huì)在柑橘抗病研究中發(fā)揮更大的作用。