〔摘要〕 目的 觀察不同濃度的枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide， LBP)對體外高糖環境下培養的人視網膜血管內皮細胞(human retinal capillary endothelial cells， HRCEC)增殖及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)表達的影響。方法 獲取人眼球摘除術后的HRCEC，予以體外培養，選取最佳狀態的3～4代細胞;CCK8法檢測在不同濃度LBP體外高糖環境下分別作用12、24、36 h后HRCEC的增殖情況;Western blot法檢測各組HRCEC的VEGF表達情況。結果 同一時間組間比較，高糖組HRCEC活性及VEGF的表達量均高于低糖組(P<0.05);不同濃度LBP實驗組HRCEC活性及VEGF表達量均明顯低于高糖組(P<0.05)，80 μg/mL LBP組HRCEC活性及VEGF表達低于20 μg/mL LBP實驗組與40 μg/mL LBP實驗組(P<0.05);各實驗組在干預36 h時， HRCEC活性及VEGF表達低于干預12 h與24 h(P<0.05)。結論 LBP能抑制高糖環境下HRCEC的增殖并下調VEGF的表達，并與LBP濃度和作用時間正相關。

　　〔關鍵詞〕 枸杞多糖;人視網膜血管內皮細胞;血管內皮生長因子;高糖;新生血管

　　糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy， DR)發病率逐漸升高，世界范圍內的糖尿病患者中，DR患病率約34%[1]，DR早期癥狀隱匿，極易導致失明[2]。DR發生的主要原因是視網膜缺血缺氧，血管內皮細胞增殖，VEGF高表達，最終視網膜新生血管(retinal neovascularization， RNV)形成，DR的主要并發癥是視網膜出血與黃斑水腫(diabetic macular edema， DME)。玻璃體腔注射抗VEGF藥物雖然是DR并發黃斑水腫的一線治療方法[3]，但抗VEGF藥物(雷珠單抗、貝伐單抗、阿柏西普、康柏西普等)價格昂貴、作用時間短[4]。尋求價格低廉、安全有效的抗VEGF藥物成為目前DR研究的熱點。枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide， LBP)是一種天然水溶性多糖，藥理作用廣泛。LBP可以降低DM小鼠的視網膜炎癥反應、氧化應激反應及血管新生[5]，LBP還可以抑制VEGF、Ang及其受體在DM小鼠視網膜中的表達，具有治療DR的作用。既往雖然較多關于LBP在糖尿病、血管內皮細胞等方面的研究，但尚未發現在人視網膜血管內皮細胞(human retinal capillary endothelial cells， HRCEC)的相關研究，本文基于LBP對小鼠糖尿病VEGF抑制作用的基礎上，研究了LBP對高糖環境下HRCEC及VEGF的影響，期望為研發防治DR新藥物提供基礎研究。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗材料

　　1.1.1 主要試劑 胎牛血清(Gibco公司，貨號04-001-1ACS);LBP(陜西康盛生物技術有限公司，KS118，純度35%);兔抗人VEGF 抗體(博奧森公司，貨號bs-0279R);β-actin(Mouse)、HRP goat anti-mouse IgG、HRP goat anti-rabbit IgG(美國proteintech公司，貨號依次為：66009-1-Ig、SA00001-1、SA00001-2);高糖培養基(SIGMA公司，貨號D5796);蛋白預染Marker(Thermo公司);SuperECL Plus超敏發光液(美國Advansta公司，貨號K-12045-D50);胰酶消化液、RIPA裂解液(中國上海碧云天生物有限公司，貨號C0201、P0013B);顯影液、定影液(中國上海佳信公司，BW-61、BW-62);蛋白裂解液(中國上海碧云天公司，貨號P0013B);TEMED(中國上海阿拉丁公司，T105497);SDS(中國大連美倫公司，貨號MB2479);第Ⅷ因子相關抗原抗體(Abcam公司)。

　　1.1.2 LBP溶液的配制 LBP母液配置：稱取35%含量LBP 10 mg，加入10 mL DMEM高糖培養基稀釋，搖勻、溶解，500 r/min離心5 min，雙層0.22 μm微孔濾膜過濾細菌及沉淀，并密封分裝，4 ℃保存。此時母液配置完成，含量為1 mg/mL。配置實驗LBP濃度，移取母液200 μL置于15 mL離心管中，加入DMEM高糖培養基至10 mL，反復搖勻，配置成20 ?滋g/mL LBP，做好標記，置于4 ℃冰箱保存。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 HRCEC的培養 在南華大學第二附屬醫院手術室選取角膜移植手術后余下的眼球，慶大霉素注射液浸泡30 min，分離視網膜神經上皮層，常溫下2%胰蛋白酶消化，過濾，加入20%小牛血清培養液停止消化，1 200 r/min離心8 min，去除上清液，在離心管內加入10% Gibico FBS+1%雙抗的DMEM培養基吹打混勻，接種于含有10% Gibico FBS+1%雙抗的DMEM培養基，再置入37 ℃、5% CO2培養箱培養。待細胞鋪滿整個培養皿底部約80%時進行傳代。

　　1.2.2 HRCEC鑒定 (1)細胞爬片;(2)固定：PBST洗涕，加入4%PFA(多聚甲醛)，4 ℃細胞培養箱30 min固定;(3)按照Western blot實驗步驟進行破膜封閉、一抗孵育、二抗孵育;(4)包埋：抽取已二抗孵育好的細胞爬片，PBST緩沖液清洗，滴取1滴Fluoromount-G后蓋玻片再蓋上;(5)陽性染色鏡檢示：經過山羊抗小鼠IgG二抗橙紅色DyLight594熒光標記。顯微鏡下觀察并采集圖像。

　　1.2.3 實驗分組 取對數生長的細胞進行分組：(1)AL組：低糖對照組(低糖+細胞);(2)AG組：高糖對照組(高糖+細胞);(3)A1組：20 μg/mL LBP實驗組;(4)A2組：40 μg/mL LBP實驗組;(5)A3組：80 μg/mL LBP實驗組。其中低糖濃度為1 g/L，高糖濃度為4.5 g/L;實驗組為不同濃度LBP+高糖培養基+細胞。

　　1.2.4 CCK8法行細胞增殖活性的檢測 取對數生長期的細胞，消化計數，以5×103個細胞/孔密度接種于96孔板內，每孔100 μL。各組均設5個復孔，培養貼壁，每孔加入10 μL/孔的CCK8，用完全培養基配置CCK8溶液，去除含藥培養基每孔加入100 μL含有CCK8的培養基。37 ℃，5% CO2繼續孵育4 h后于Bio-Tek酶標儀測定450 nm處吸光度(OD)值，測定各組HRCEC的增殖活性。

　　增殖抑制率=(高糖對照組OD值-藥物干預組OD值)/高糖對照組OD值×100%

　　1.2.5 Western blot 蛋白檢測 (1)PBS洗滌細胞，3 000 r/min離心2 min，加入120 μL RIPA裂解液，超聲破碎1.5 min;冰上裂解;4 ℃，12 000 r/min離心15 min;取上清液。按照BCA法，測定550nm之間波長的吸光值，根據標準曲線計算蛋白濃度。(2)樣品準備：取80 μL蛋白上清，加入20 μL 5*loading buffer混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷備用。(3)電泳：點入marker 2 μL，其它按照分組順序每孔上樣15 μL已變性蛋白。恒定電壓75 V，130 min。(4)轉膜：分別切膠VEGF(24kD)，β-actin(42kD);300 mA恒定電流轉膜，VEGF約39 min，β-actin 約60 min。(5)封閉：用1*PBST配制5%脫脂奶粉，室溫封閉60 min，4 ℃過夜，次日室溫放置30 min。(6)一抗孵育：加入一抗(Rabbit Anti-VEGF antibody (bs-0279R)，1∶1 000;Mouse anti-β-actin antibody(66009-1-Ig)1∶5 000，室溫孵育90 min;1*PBST洗3次，每次15min。(7)二抗孵育：加入二抗(HRPgoatanti-mouse IgG，SA00001-1，1∶5 000;HRPgoat anti-rabbit IgG，SA00001-2，1∶6 000)溫孵育90 min后1*PBST洗3次，每次10 min。(8)顯色/曝光：化學發光法(chemiluminescence， ECL)顯色曝光，顯影沖洗，Image lab軟件分析灰度值。

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