摘要：研究了不同質(zhì)量濃度(4 μg/mL，8 μg/mL，12 μg/mL和16 μg/mL)的吡咯喹啉醌(PQQ)對(duì)水芹種子萌發(fā)過(guò)程的影響，結(jié)果表明：在PQQ的作用下，水芹種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和呼吸強(qiáng)度均隨著PQQ質(zhì)量濃度的增加而提高，其中質(zhì)量濃度為16 μg/mL的PQQ浸種效果最佳，PQQ具有促進(jìn)水芹種子萌發(fā)的生理效應(yīng);PQQ的作用對(duì)水芹種子中淀粉酶活力影響不大，對(duì)脂肪酶和過(guò)氧化物酶活力有著明顯的增強(qiáng)作用.

　　關(guān)鍵詞：吡咯喹啉醌;水芹;種子萌發(fā);生理效應(yīng)

　　《工程與試驗(yàn)》(季刊)創(chuàng)刊于1961年，由中國(guó)儀器儀表學(xué)會(huì)試驗(yàn)機(jī)分會(huì)、長(zhǎng)春試驗(yàn)機(jī)所主辦。本刊秉承“宣傳貫徹科學(xué)技術(shù)是第一生產(chǎn)力的思想，介紹新的科技成果，傳播新的科技信息，普及科學(xué)知識(shí)、科學(xué)方法和科學(xué)思想，促進(jìn)生產(chǎn)力的發(fā)展”的辦刊宗旨;奉行“科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)、務(wù)實(shí)、求真”的辦刊方針。

　　0 引言

　　1960年代，一種新型維生素吡咯喹啉醌PQQ(pyrroloquinoline quinone)被科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，它廣泛存在于水果、蔬菜、谷物等食品中，是許多細(xì)菌中甲醇脫氫酶、葡萄糖脫氫酶GDH(glucosedehydrogenase)、甘油脫氫酶等的輔酶，能夠參與呼吸鏈電子傳遞[1-2].但是，只有部分革蘭氏陰性菌能夠自身合成PQQ，而人類(lèi)與動(dòng)植物主要從外界獲取該維生素[3-4].

　　研究表明，PQQ可以縮短植物生長(zhǎng)停滯期，促進(jìn)植物細(xì)胞新陳代謝和生長(zhǎng)[5].

　　張鵬等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在小麥植株生理代謝調(diào)節(jié)過(guò)程中，PQQ可增加葉綠素含量，使光合速率增加，并提高硝酸還原酶和谷氨轉(zhuǎn)氨酶活性，從而減少穗部小花敗育，提高小麥結(jié)實(shí)率.

　　匡煒等[7]的研究表明，PQQ能有效提高湘早秈45號(hào)水稻的每穗實(shí)粒數(shù)和結(jié)實(shí)率，減少每穗空粒數(shù)，對(duì)水稻增產(chǎn)有促進(jìn)作用.另外，PQQ作為GDH

　　的氧化還原輔因子，可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，溶解不溶性磷酸鹽到土壤中，促進(jìn)植物吸收生長(zhǎng)[8].PQQ還可以促進(jìn)玫瑰紅蘋(píng)果和紅富士蘋(píng)果花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)，但濃度過(guò)高則會(huì)減弱效果，甚至產(chǎn)生抑制效應(yīng)，且紅富士蘋(píng)果較玫瑰紅蘋(píng)果更為敏感，當(dāng)PQQ濃度高于1 μmol/L時(shí)即產(chǎn)生明顯的抑制效應(yīng)[9].

　　總之，PQQ能促進(jìn)某些植物生長(zhǎng)，但其對(duì)水芹種子的萌發(fā)過(guò)程是否有影響尚不明確.本文擬以水芹種子為原料，研究不同質(zhì)量濃度的PQQ對(duì)水芹種子萌發(fā)的影響，并進(jìn)一步研究PQQ的作用對(duì)種子萌發(fā)過(guò)程中關(guān)鍵酶(淀粉酶、脂肪酶和過(guò)氧化物酶)活性的影響，以明晰PQQ對(duì)水芹種子萌發(fā)的生理效應(yīng)和作用機(jī)制.

　　1 材料與方法

　　1.1 材料與試劑

　　實(shí)驗(yàn)材料：水芹種子，購(gòu)于鄭州市種子公司;吡咯喹啉醌(色譜純)，由瀚香生物科技公司提供.

　　實(shí)驗(yàn)試劑：3，5-二硝基水楊酸、甲苯、乙醇，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn);愈創(chuàng)木酚，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn);橄欖油、乙醚，生工生物工程上海股份有限公司產(chǎn);百里香酚酞，廣東光華化學(xué)廠有限公司產(chǎn).以上試劑均為分析純.

　　1.2 儀器與設(shè)備

　　HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫(yī)療器械有限公司產(chǎn);SHP-250型恒溫光照培養(yǎng)箱，上海鴻都電子科技有限公司產(chǎn);2300型UV-分光光度計(jì)，尤尼克(上海)有限公司產(chǎn);Sartorius PB-10型pH酸度計(jì)，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠產(chǎn).

　　1.3 實(shí)驗(yàn)方法

　　1.3.1 水芹種子萌發(fā)

　　取大小均勻的水芹種子，將其分為5組，每組20粒.用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的NaClO浸種20 min，蒸餾水洗凈，再用不同質(zhì)量濃度的PQQ(4 μg/mL，8 μg/mL，12 μg/mL和16 μg/mL)室溫浸種48 h，用3 mL不同質(zhì)量濃度的PQQ溶液浸潤(rùn)濾紙，并將種子點(diǎn)播吸附在濾紙上，置于恒溫培養(yǎng)箱中于25 ℃下光照培養(yǎng).其間補(bǔ)加相應(yīng)質(zhì)量濃度的PQQ以保持濾紙的濕潤(rùn)[10].實(shí)驗(yàn)持續(xù)5 d，每d記錄正常發(fā)芽種子數(shù).按以下公式計(jì)算水芹種子的各種活力指標(biāo).

　　發(fā)芽率=種子發(fā)芽數(shù)供實(shí)驗(yàn)種子數(shù)×100%

　　1.3.2 呼吸強(qiáng)度測(cè)定

　　呼吸強(qiáng)度，是植物體新陳代謝強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)，它是指單位面積或單位質(zhì)量的植物體，在單位時(shí)間內(nèi)所吸收的O2或釋放的CO2量或損失的干重.

　　用飽和堿液吸收一定量的植物材料在單位時(shí)間內(nèi)放出的CO2，再用標(biāo)準(zhǔn)酸液滴定，即能測(cè)得植物的呼吸強(qiáng)度.

　　參照李海霞等[11]的方法，用上述不同質(zhì)量濃度的PQQ對(duì)種子進(jìn)行浸種處理，實(shí)驗(yàn)持續(xù) 5 d，每d對(duì)呼吸速率進(jìn)行測(cè)定，然后按以下公式計(jì)算呼吸強(qiáng)度.

　　其中，V0為空白滴定用去的草酸量/mL，V1為樣品滴定用去的草酸量/mL，W為樣品鮮重/g，T為測(cè)定時(shí)間/h.

　　1.3.3 酶活力測(cè)定

　　1.3.3.1 淀粉酶活力測(cè)定

　　參照張志鵬[12]的方法，采用3，5-二硝基水楊酸還原法，每12 h對(duì)不同質(zhì)量濃度PQQ浸種處理的水芹種子中淀粉酶活性進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)持續(xù)3 d。酶活力定義為每g樣品在單位時(shí)間內(nèi)生成還原糖(麥芽糖)的量.

　　麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別配制0 mg/mL，0.2 mg/mL，0.4 mg/mL，0.6 mg/mL，0.8 mg/mL 和1.0 mg/mL的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL于刻度試管中，加3.0 mL 二硝基水楊酸(DNS)試劑，搖勻，沸水浴10 min后經(jīng)流水冷卻，加蒸餾水定容至15 mL，在520 nm 的波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值，并建立通過(guò)吸光度值求麥芽糖質(zhì)量濃度的回歸方程.

　　淀粉酶液制備：稱取1 g經(jīng)不同質(zhì)量濃度PQQ溶液作用的水芹種子于研缽中，加入5 mL蒸餾水，研磨勻漿后倒入離心管中，再用10 mL蒸餾水分次將殘?jiān)慈腚x心管.在室溫下靜置 20 min 制備提取液，每隔5 min攪動(dòng)1次，使其充分提取.在4 ℃條件下3000 r/min低溫離心10 min，取上清液加蒸餾水定容至100 mL后搖勻，即為淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力測(cè)定.取淀粉酶原液10 mL，用蒸餾水定容至 50 mL 后搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于淀粉酶活力的測(cè)定.

　　1.3.3.2 脂肪酶活力測(cè)定

　　脂肪酶可以分解種子中貯藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為種子萌發(fā)的異養(yǎng)階段提供能量[13].

　　參照GB/T 5523—2008[14]，稱取2 g水芹種子于研缽中，加入1.0 mL橄欖油，混勻，加入5.0 mL pH=7.5的磷酸緩沖液，研磨后轉(zhuǎn)入100 mL錐形瓶中，用5.0 mL蒸餾水洗凈研缽，洗液全部轉(zhuǎn)入錐形瓶中，加3滴甲苯，置于30 ℃恒溫箱內(nèi)，保溫24 h后取出.加入V(乙醇)GA6FAV(乙醚)=4GA6FA1的混合液50 mL，靜置5 min，加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的百里香酚酞乙醇溶液指示劑，用0.2 mol/L氫氧化鈉乙醇溶液滴定至終點(diǎn)(淺藍(lán)色)，記錄用去堿液的體積(V2).另外稱取2 g相應(yīng)質(zhì)量濃度試樣做對(duì)照試驗(yàn)，除不用 30 ℃ 保溫24 h外，其余操作同上，記下用去的堿液體積(V3).

　　每12 h對(duì)不同質(zhì)量濃度PQQ作用的水芹種子進(jìn)行脂肪酶活性測(cè)定，實(shí)驗(yàn)持續(xù) 3 d.

　　其中，V2為試樣滴定用去的堿液體積/mL，V3為對(duì)照試驗(yàn)用去的堿液體積/mL，N為實(shí)際堿液質(zhì)量濃度/(mol·L-1)，W1為試樣質(zhì)量/g，M為試樣水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%.

　　1.3.3.3 過(guò)氧化物酶活力測(cè)定

　　過(guò)氧化物酶是以過(guò)氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶，與呼吸作用、光合作用、生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系[15].

　　分別取0.5 g經(jīng)不同質(zhì)量濃度PQQ作用的水芹種子于研缽中，加入液氮后充分研磨，再加入3.0 mL磷酸緩沖液，預(yù)冷5 min，7000 r/min 離心15 min，上清液為粗酶提取液，提取后低溫保存待用.

　　酶活力測(cè)定的反應(yīng)體系為：0.05 mol/L磷酸緩沖液2.9 mL;2%的H2O2 1.0 mL;0.05 mol/L 愈創(chuàng)木酚 1.0 mL;酶液0.1 mL.用加熱煮沸5 min的酶液作為對(duì)照.反應(yīng)體系加入酶液后，立即于34 ℃水浴保溫30 s，在 470 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，開(kāi)始記錄數(shù)據(jù)，然后每 0.5 min 記錄一次吸光度值，共測(cè)2 min.

　　以每min A470的變化值0.01為一個(gè)相對(duì)酶活單位U，計(jì)算植物組織內(nèi)過(guò)氧化物酶活力的大小.每12 h對(duì)經(jīng)不同質(zhì)量濃度PQQ作用的水芹種子進(jìn)行過(guò)氧化物酶活力測(cè)定，實(shí)驗(yàn)持續(xù)3 d.

　　其中，Vt為酶液的總體積/mL，ΔA470為吸光度的變化值，t為間隔時(shí)間/min，Vs為測(cè)定時(shí)取用的酶液體積/mL，W2為粒種子的質(zhì)量/g.

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 不同質(zhì)量濃度的PQQ對(duì)水芹種子萌發(fā)的影響

　　水芹種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，以胚根突破種皮1 mm作為種子發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)(圖1a))，萌發(fā)初期(即培養(yǎng)期的前96 h)組間差異不明顯，水芹種子基本不發(fā)芽或者剛剛露白(圖1b)).圖2為中后期水芹種子萌發(fā)情況.由圖2可知，在4種質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，PQQ質(zhì)量濃度越高，對(duì)種子萌發(fā)的促進(jìn)作用越明顯.在質(zhì)量濃度為16 μg/mL的PQQ作用下，種子萌發(fā)到120 h時(shí)的發(fā)芽率為43.4%，對(duì)照組發(fā)芽率為33%;至192 h時(shí)的發(fā)芽率提升至85%，對(duì)照組發(fā)芽率為42.6%.在其他3種質(zhì)量濃度的PQQ作用下的水芹種子的發(fā)芽率均高于對(duì)照組，低于在質(zhì)量濃度為16 μg/mL的PQQ作用下的發(fā)芽率.由此可見(jiàn)PQQ能有效促進(jìn)水芹種子的萌發(fā).

　　在不同質(zhì)量濃度的PQQ作用下水芹種子的發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)如圖3和圖4所示.由圖3和圖4可知，水芹種子在萌發(fā)的第 8 d，對(duì)照組的發(fā)芽率為56.7%，在質(zhì)量濃度為 8 μg/mL 的PQQ作用下的種子發(fā)芽率為70%;在質(zhì)量濃度為16 μg/mL的PQQ作用下的種子發(fā)芽率最高，為86.7%.以萌發(fā)第5 d計(jì)算發(fā)芽勢(shì)，在質(zhì)量濃度為0～16 μg/mL的PQQ作用下，種子的發(fā)芽勢(shì)從33.3%提高到43.3%.這表明隨著PQQ質(zhì)量濃度的提高，水芹種子發(fā)芽勢(shì)逐漸增大，種子活力提高，發(fā)芽率隨之提高.