【摘要】神經(jīng)浸潤是肝門部膽管癌的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)移方式。肝門處由于在解剖上神經(jīng)、血管、淋巴管的緊密關(guān)系，腫瘤可能首先浸潤小血管、淋巴管，在神經(jīng)纖維周圍形成“衛(wèi)星”灶，繼而浸潤神經(jīng)周圍間隙[11]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示p27蛋白在無神經(jīng)浸潤的肝門部膽管癌中的陽性表達(dá)率顯著高于已經(jīng)發(fā)生神經(jīng)浸潤的腺癌(P<0.01)，說明p27蛋白低表達(dá)或陰性表達(dá)者易發(fā)生神經(jīng)轉(zhuǎn)移。

　　【關(guān)鍵詞】 肝門部膽管癌,p27蛋白,免疫組化

　　Expression of p27 in hilar cholangiocarcinoma and its clinical significance

　　【Abstract】 Objective To discuss the expression of p27 in hilar cholangiocarcinoma and explore its clinical significance.Methods Forty-four hilar cholangiocarcinoma samples and normal bile ducts tissues were collected in General Hospital of PLA from 1996 to 2000.The expression of p27 was determined by immuneohistochemical method.Results The positive rate of p27 were 77.2% in cancerous tissues，but 100% in the control group.Meanwhile，p27 expression had a significant correlation with differentiation of hilar cholangiocarcinoma，lymph node metastases and perineural invasion.The survival curve of the group with low or absent p27 expression was significantly lower than that of the group with high p27 expression.Conclusion Our results suggest that aberrant expression of p27 maybe associated with the incidence and development of hilar cholangiocarcinoma and can be regarded as prognostic markers.

　　【Key words】 hilar cholangiocarcinoma;p27;immunohistochemistry

　　p27蛋白是一個(gè)重要抑癌基因，其表達(dá)水平降低減低了它對CDK或cyclin/CDK復(fù)合物活性的抑制效應(yīng)，導(dǎo)致CDK的活化效應(yīng)遞增，使細(xì)胞能夠完成細(xì)胞周期G1～S期的重要轉(zhuǎn)換，驅(qū)動細(xì)胞周期的運(yùn)行，而使細(xì)胞增殖與分裂過快、過多乃至腫瘤形成。目前已在多種腫瘤中予以報(bào)道。但是，其在肝門部膽管癌中的表達(dá)及其作用，至今國內(nèi)外報(bào)道不多。本試驗(yàn)通過對44例肝門部膽管癌中p27的表達(dá)研究，探討其生物學(xué)意義和臨床意義。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料 選取我院1996～2000年經(jīng)手術(shù)切除、術(shù)前未行放化療、有明確病理結(jié)果及有詳細(xì)隨訪資料的肝門部膽管癌標(biāo)本44例，用中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。其中男29例，女15例，中位年齡53歲(17～73歲)。按臨床分期，Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ期0例，Ⅳ期29例，其中Ⅳa期27例，Ⅳb期2例。其中高分化腺癌13例，中分化腺癌17例，低分化腺癌9例。對照組標(biāo)本選取行根治性切除的膽管癌標(biāo)本的遠(yuǎn)端切緣的正常膽管組織。

　　1.2 方法 鼠抗人p27蛋白單克隆抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，工作濃度為1∶20。抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒購于上海基因有限公司。免疫組化染色采用兩步法(做高溫高壓抗原修復(fù))。用已知p27蛋白陽性的正常扁桃體組織(由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)作為陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照。

　　1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 參考Michelangelo Fiorentino[1]p27蛋白以細(xì)胞核或胞核伴胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果，每張切片選5個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按陽性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞的百分比。p27的表達(dá)分為，高表達(dá)組：陽性細(xì)胞≥50%;低表達(dá)組：陽性細(xì)胞<50%;及陰性表達(dá)組，無陽性細(xì)胞染色。

　　1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用四格表χ2檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比較采用Log-rank檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性。Kaplan-Meier曲線由Stata自動生成。

　　2 結(jié)果

　　2.1 p27蛋白在肝門部膽管癌中的表達(dá) p27蛋白染色陽性細(xì)胞為細(xì)胞核著色。p27蛋白陽性率為77.3%(34/44)，以低表達(dá)為主。其中高表達(dá)14例(31.8%)，低表達(dá)20例(45.5%)，陰性表達(dá)10例(22.7%)。而對照組中，p27蛋白陽性率為100%(8/8)，以高表達(dá)為主。

　　2.2 p27蛋白表達(dá)與膽管癌臨床病理的關(guān)系 肝門部膽管癌組織中的p27陽性表達(dá)與年齡、腫瘤分化、神經(jīng)及淋巴的轉(zhuǎn)移呈顯著相關(guān)(P<0.05);p27在高、中分化的肝門部膽管癌中的陽性表達(dá)率明顯高于低分化的肝門部膽管癌，兩者差異有非常顯著性(P<0.01)。而p27表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤浸潤深度、腫瘤分型[2]、血管轉(zhuǎn)移、臨床分期等無顯著性相關(guān)(見表1)。

　　2.3 p27蛋白與生存隨訪的關(guān)系 所有病例皆有完整隨訪資料。p27蛋白高、低及陰性表達(dá)組的平均生存時(shí)間分別為84個(gè)月、72個(gè)月與65個(gè)月。p27高、低表達(dá)及缺失表達(dá)組各組生存率經(jīng)Logrank檢驗(yàn)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異無顯著性，但在卡-邁二氏曲線上，p27的高表達(dá)組生存曲線明顯高于低表達(dá)組與缺失組的生存曲線。

　　3 討論

　　p27Kip1是Polyk等[3]于1994年首先克隆出來的，為CDKI家族成員之一，主要作用于G1期，抑制cyclin/CDK復(fù)合物的活性，阻止pRb磷酸化，使細(xì)胞周期停滯于G1期，抑制細(xì)胞增殖。近年研究發(fā)現(xiàn)，在多種消化道腫瘤中[4～6]，p27Kip蛋白表達(dá)異常與腫瘤的進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)。

　　3.1 p27Kip蛋白表達(dá)異常原因 在本組病例中，p27蛋白陽性染色定位于腫瘤及正常上皮細(xì)胞的胞核內(nèi)，不同于羅昆侖“p27主要位于腫瘤及正常上皮細(xì)胞胞漿”的報(bào)道[7]。本組病例中p27蛋白的陽性表達(dá)率為77.2%，不同于國內(nèi)劉岳蘭等[8]關(guān)于膽管癌的p27的陽性表達(dá)率為40.82%的報(bào)道。不同的原因考慮有：(1)取材導(dǎo)致混淆。國內(nèi)有關(guān)膽管癌p27蛋白的研究的取材包括肝內(nèi)、肝外及肝門部的膽管癌組織，其p27蛋白的陽性率不能代表肝門部膽管癌p27蛋白的陽性率。(2)可能和腫瘤位置的特異性有關(guān)。膽管癌不同部位的p27蛋白表達(dá)率不同。Michelangelo Fiorentino[1]進(jìn)行了47例手術(shù)切除的肝內(nèi)膽管癌，肝門部膽管癌22例與周圍肝內(nèi)膽管癌(peripheral intrahepati cholangiocarcinoma)25例的p27蛋白的檢測，發(fā)現(xiàn)肝門部膽管癌的陽性率為59.1%，而外周性肝內(nèi)膽管癌p27的陽性表達(dá)率則為88%。Jarnagin等[9]分析了1992～2002年間經(jīng)手術(shù)切除的標(biāo)本的細(xì)胞周期蛋白p53、cyclin D1、p21、Bcl2、p27、Mdm2和Ki-67的表達(dá)情況。其中膽管癌根據(jù)來源分為肝內(nèi)膽管癌、肝門部膽管癌、膽囊癌和遠(yuǎn)端膽管癌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)p27的表達(dá)隨膽樹的近端向遠(yuǎn)端延伸而呈進(jìn)行性下降，其得出結(jié)論：膽管癌表現(xiàn)不同的細(xì)胞周期蛋白，這些蛋白的表達(dá)取決于腫瘤位置和腫瘤的形態(tài)。

　　肝門部膽管癌組織中p27蛋白表達(dá)以低表達(dá)為主。Motagnolia等[10]認(rèn)為：一旦受到惡性增殖信號的刺激，p27Kip1的蛋白表達(dá)水平下降，一方面由于合成降低，更主要的是通過細(xì)胞蛋白翻譯后泛素蛋白酶體降解途徑的速度提高。p27蛋白水平功能的下降減低了它對CDK或cyclin/CDK復(fù)合物活性的抑制效應(yīng)，導(dǎo)致CDK的活化效應(yīng)遞增，使細(xì)胞能夠完成細(xì)胞周期G1～S期的重要轉(zhuǎn)換，驅(qū)動細(xì)胞周期的運(yùn)行，而使細(xì)胞增殖、分裂過快、過多乃至腫瘤形成。我們推測p27蛋白在肝門部膽管癌中的低表達(dá)有可能緣于相同的機(jī)制。

　　3.2 p27在肝門部膽管癌進(jìn)展中的作用 本試驗(yàn)高、中分化的肝門部膽管癌中的p27陽性表達(dá)率明顯高于低分化的肝門部膽管癌，兩者差異有非常顯著性(P<0.01)。這說明在高度惡性的肝門部膽管癌中p27的表達(dá)要低于惡性程度較低者，其可作為一個(gè)預(yù)示惡性程度的指標(biāo)。

　　p27蛋白在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)陽性率明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。以上說明p27蛋白的低表達(dá)或丟失可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和改變細(xì)胞間的黏附力，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

　　以上說明p27蛋白的表達(dá)程度與腫瘤的分程演變、分化程度密切相關(guān)，也就是說肝門部膽管癌的分化程度越低，腫瘤浸潤范圍越廣，p27蛋白的表達(dá)就越低或缺失越高，這提示肝門部膽管癌的病程演變發(fā)展與p27蛋白缺失有關(guān)。這和國外報(bào)道相似[12]。以上充分說明p27是一種抑癌基因蛋白，在肝門部膽管癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

　　3.3 p27與預(yù)后 p27高、低表達(dá)及缺失表達(dá)組各組生存率經(jīng)Logrank檢驗(yàn)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著性差異，但在卡-邁二氏曲線上，p27的高表達(dá)組生存曲線明顯高于低表達(dá)組與缺失組的生存曲線，且高表達(dá)組的平均生存時(shí)間84個(gè)月明顯長于低表達(dá)組及缺失組的中位生存時(shí)間，后者分別為72個(gè)月與65個(gè)月。當(dāng)增加樣本量時(shí)可望得到各組生存率存在差異性的結(jié)論。這說明p27高表達(dá)組的預(yù)后要好于低表達(dá)組及缺失組。

　　綜上所述，p27是一個(gè)抑癌基因，可抑制細(xì)胞惡性增殖。p27蛋白的減少或缺失與肝門部膽管癌的的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有密切關(guān)系，可望成為一個(gè)預(yù)測肝門部膽管癌術(shù)后復(fù)發(fā)的指標(biāo)。對p27的進(jìn)一步研究，有助于深入了解肝門部膽管癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，并可為判斷預(yù)后提供一定的依據(jù)，有利于改善預(yù)后。