【摘要】僵蠶為蠶蛾科昆蟲家蠶 Bombyx mori L. 4～5齡的幼蟲感染(或人工接種)白僵菌 Beauveria bassiana(Bals.) Vuill.而致死的干燥體。多于春、秋季生產(chǎn)，將感染白僵菌病死的蠶干燥。文章發(fā)表在《中外女性健康》上，是醫(yī)學(xué)核心期刊發(fā)表范文，供同行參考。

　　【關(guān)鍵詞】：僵蠶,抗凝活性部位,化學(xué)成分,凝膠色譜法,高效液相色譜法,氮測定法

　　僵蠶略呈圓柱形，多彎曲皺縮。長2～5cm，直徑0.5～0.7cm。表面灰黃色，被有白色粉霜狀的氣生菌絲和分生孢子。頭部較圓，足8 對，體節(jié)明顯，尾部略呈二分歧狀。質(zhì)硬而脆，易折斷，斷面平坦，外層白色，中間有亮棕色或亮黑色的絲腺環(huán) 4 個。氣微腥。味微咸。

　　1 實驗材料

　　Waters 515 HPLC系統(tǒng)(Waters 公司);BS100A自動部分收集系統(tǒng)(上海市滬西儀器廠);Start-4半自動四通道血凝儀(法國STAGO公司);4300-Pro紫外分光光度計(瑞士安瑪西亞公司);HR2838型勻漿機(菲力普公司);LP115 pH計(METTER TOLEDO公司);DDS-ⅡA電導(dǎo)率儀(上海理達(dá)儀器廠);移液槍(0.1 mL和1.0 mL,日本);半微量凱氏定氮裝置;Z-16和Z-26層析柱(上海化學(xué)儀器廠)。

　　2 方法與結(jié)果

　　2.1 樣品溶液的制備

　　稱取制僵蠶1 500 g(樣品A),用8倍量水浸泡過夜,以3 000 r/min勻漿,然后煎煮2次,每次30 min,過濾,合并濾液,離心,得提取液8 450 mL(樣品B),將其濃縮至含原藥材2 g/mL,加無水乙醇濃度至60%,4 ℃放置過夜,3 000 r/min離心,取上清液水浴濃縮至含原藥材約6 g/mL,即得粗提液240 mL(樣品C)。

　　2.2 抗凝活性部位的化學(xué)成分理化鑒別

　　2.2.1 茚三酮反應(yīng)、pH值、電導(dǎo)率、AgNO3/HNO3反應(yīng)和CaCl2/HNO3反應(yīng) 分別取B～E樣品溶液進(jìn)行理化測定,結(jié)果表明,僵蠶提取分離后的B～E樣品所檢測的理化性質(zhì)結(jié)果一致,提示所含主要成分基本相同。茚三酮反應(yīng)陽性,活性部分電導(dǎo)很大,與AgNO3產(chǎn)生白色沉淀,滴加HNO3后沉淀部分溶解,與CaCl2產(chǎn)生沉淀,滴加HNO3沉淀溶解。提示抗凝活性成分可能是鹽類(如氯化物、草酸鹽等)、蛋白質(zhì)、肽類或其它含氨基酸的化合物。

　　2.2.2 紫外吸收光譜

　　圖2表明,樣品B～E的UV光譜形狀均不相同,表明提取分離所得樣品化學(xué)成分有所不同。提取分離后除去了大量的無活性物質(zhì),特別是經(jīng)過凝膠色譜純化后,UV光譜變化較大。

　　2.2.3 樣品E的凝膠色譜分析及其分子量分析

　　取樣品E中TT≥600 s的餾分2 mL上Sephadex G-15(φ1.6 cm×50 cm)柱,用水洗脫鹽,4.0 mL/(10 min·管),自動分步收集器收集,測定各管的TT值、260 nm和280 nm處的吸光度及化學(xué)反應(yīng)特性,結(jié)果見表1。表1 TT≥600 s餾分的凝膠柱脫鹽中餾分的抗凝活性和理化特性檢

　　2.3 定量分析

　　2.3.1 固形物含量測定

　　精密吸取樣品B～E各2.0 mL,80 ℃下烘至近干,100 ℃下烘至恒重,精密稱定,按每1 mL樣品溶液扣除5.0 mg的Tris和NaCl重量,得固形物重量和濃度(各樣品均為n=3,RSD不超過0.8%),結(jié)果見表2。表2 僵蠶各部位中的固形物和蛋白質(zhì)測定結(jié)果(略)注：*與樣品A比

　　2.3.2 指標(biāo)檢測

　　蛋白質(zhì)：按《中華人民共和國藥典》中半微量氮測定法操作,計算總氮含量。將該氮含量扣除銨態(tài)氮含量,再與6.25相乘,即為蛋白質(zhì)質(zhì)量和百分濃度(W/V)。各樣品均為n=3,RSD不超過1.4%。銨根[9]：按《中華人民共和國藥典》中半微量氮測定法操作(40% NaOH試液用120 g/L氧化鎂懸濁液代替),計算銨根質(zhì)量和百分濃度(W/V)。各樣品均為n=3,RSD不超過1.2%。草酸根[3]：精密取B～E樣品液約5 mL,氯化鈣沉淀-高錳酸鉀滴定法測定(各樣品均為n=3,RSD不超過1.0%)。結(jié)果見表3、表4。表3 僵蠶各部位中銨根和草酸根的測定結(jié)果(略)注：*與樣品B比表4 僵蠶各部位固形物中蛋白質(zhì)和草酸銨含量比較(略)

　　2.3.3 HPLC法測定氨基酸含量

　　2.3.3.1 色譜條件

　　色譜柱：Agilent ODS(4.6 mm×200 mm, 5 μm);流動相A為50 mmol/L NaAc(pH 6.8)-甲醇-THF(82∶17∶1),流動相B為50 mmol/L NaAc(pH 6.8)-甲醇-THF(22∶77∶1),梯度洗脫;柱溫：27 ℃;流速：1.0 mL/min;熒光檢測器：λex 338 nm,λem 425 nm。

　　2.3.3.2 樣品測定 樣品溶液B～E經(jīng)5.7 mol/L鹽酸液,在110 ℃水解24 h,OPA試劑衍生化,然后取20 μL注入液相色譜儀。測定結(jié)果見表5。表5 僵蠶各部位中氨基酸的測定結(jié)果(略)

　　3 討論

　　本研究表明,僵蠶的水煎煮提取、醇沉和凝膠色譜分離所得抗凝活性部位中,多肽、氨基酸類和草酸銨都是其中的主要成分。已有報道,草酸銨具有抗凝活性[8],本研究表明,凝膠色譜分離部位中不含草酸銨,但含多肽和氨基酸類成分的餾分具有抗凝活性,因此,僵蠶中的多肽類或氨基酸類成分可能是抗凝活性成分之一。本研究對僵蠶抗凝活性部位的化學(xué)成分和理化特性進(jìn)行的初步探索,也為今后對僵蠶抗凝成分的分離純化提供了實驗基礎(chǔ)。

　　中國醫(yī)學(xué)核心期刊征稿：《中外女性健康》是由武漢大學(xué)主辦，中外女性健康雜志社編輯出版的綜合性醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)期刊，本刊以各級醫(yī)、護(hù)、檢、藥、管、教、研人員為主要讀者對象，主要反映臨床醫(yī)學(xué)研究成果，突出報道醫(yī)學(xué)新理論、新知識、新技術(shù)成果。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　[1] 張貴君.現(xiàn)代中藥材商品通鑒[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社,2001. 2447-2449.

　　[2] 衛(wèi)功慶,鞠貴春,李慧萍,等.白僵蠶化學(xué)成分的分析[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1995,17(3)：46-49.

　　[3] 彭新君,彭延古,曾序求,等.僵蠶提取液中蛋白質(zhì)和草酸銨等成分的定量分析[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2005,12(9)：38-40.