【摘要】 目的 探索高頻彩色多普勒超聲與實際游標卡尺測量腫瘤的相關性。方法 將0.10 mL 2×106 DU145細胞懸液注射到裸鼠前列腺包膜下。細胞注射后第2周至第5周使用高頻彩色多普勒超聲測量裸鼠腫瘤橫徑與縱徑。麻醉狀態下解剖裸鼠，游離腫瘤，游標卡尺測量腫瘤橫徑與縱徑。腫瘤放入1.3 mol?L-1甲醛中固定，HE染色。結果 高頻彩色多普勒超聲測量的橫徑與使用游標卡尺測量的橫徑相比，Pearson與Spearman相關系數分別是0.996(P<0.001)與0.964(P<0.001);高頻彩色多普勒超聲測量的橫徑與使用游標卡尺測量的縱徑相比，Pearson與Spearman相關系數分別是0.988(P<0.001)與0.898(P<0.01)。結論 高頻彩色多普勒超聲可精確地監測裸鼠前列腺原位種植腫瘤的生長。

　　【關鍵詞】 高頻彩色多普勒超聲 原位種植 前列腺腫瘤 動物模型

　　Abstract: Objective To investigate the growth of tumor of dependablity between ultrasonography and vernier caliper.Methods Tumor cell were implanted into capsula prostatica of nude mice with 0.1 mL 2×106 DU145 cell suspensions.And detected the tumor′s transverse diameter and vertical diameter by high frequency color doppler ultrasound in the 2nd,3rd,4th,5th week after injection.The nude mice were dissected under narcotism,and dissociated the tumor,mearsured transverse diameter and vertical diameter of tumor by vernier caliper.Then the tumor was fixed in 1.3 mol?L-1 formaldehyde and stained by HE.Results The result of tumor measured by ultrasonography and vernier caliper had a strong correlation:the coefficient of correlation of Pearson and Spearman were 0.996(P<0.001) and 0.964(P<0.001) in transversal diameter,0.988(P<0.001) and 0.898(P=0.006) in vertical diameter.Conclusion High frequency color doppler ultrasound can monitor the growth of orthotopic prostate tumor of nude mouse punctually.

　　Key words: high frequency color Doppler ultrasound;orthotopic implantation;prostate tumor;animal model

　　當今進行抗腫瘤藥物的臨床前實驗，常使用裸鼠或重癥聯合免疫缺陷鼠(severe combined immune deficiency，SCID)。在其皮下種植腫瘤而建立動物模型，給予抗腫瘤藥物干預，并通過游標卡尺測量腫瘤體積的變化，來評價抗腫瘤藥物的治療效果。但是對于前列腺原位種植腫瘤，由于腫瘤生長在腹腔內，位置較深，不可以使用卡尺直接進行體表測量。本研究采用高頻彩色多普勒超聲對每只裸鼠原位種植腫瘤進行測量，隨即解剖裸鼠，顯露腫瘤進行卡尺測量，比較超聲與實際卡尺測量的相關性。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料 BALB/C雄性裸鼠,6～8周齡，體質量22～24 g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，并在北京大學人民醫院動物實驗室無特定病原體動物(Specific Free Animal,SPF)條件的層流架內飼養，飲水自由攝入。雄激素非依賴性前列腺癌細胞系DU145由北京大學第一醫院泌尿外科研究所饋贈，北京大學人民醫院中心實驗室進行常規細胞培養。高頻彩色多普勒超聲(GE公司LOGIW9高頻彩色多普勒超聲)測量腫瘤由北京大學人民醫院超聲科完成。腫瘤標本的甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色在北京大學人民醫院中心實驗室完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 細胞培養 復蘇凍存的前列腺癌細胞系DU145，用含體積分數10%胎牛血清(杭州四季青公司)的1640培養液(北京天潤善達公司)在37 ℃、50 mL?L-1CO2孵箱內培養。2.5 g?L-1的胰酶與體積分數0.02%的EDTA(杭州吉諾生物公司)消化傳代培養。腫瘤細胞貼壁生長。由于DU145細胞系生長迅速，應注意每天給細胞換液。

　　1.2.2 原位種植模型建立 當腫瘤細胞生長至對數增長期，胰酶消化，1000 r?min-1離心5 min(無錫瑞江牌離心機，型號RJTDL40B),重新懸于無血清的1640培養液中，調整細胞密度，臺盼藍染色選擇細胞存活率大于90%的細胞懸液。繼續用無血清的1640培養液調整細胞濃度2×107 ?mL-1。裸鼠采用質量分數0.7%戊巴比妥鈉0.01 mL?g-1腹腔注射麻醉。取仰臥位，膠帶固定四肢，酒精消毒皮膚，取下腹部低位橫切口，小心分離皮下組織、脂肪、肌肉層后進入腹腔，游離膀胱至頸部，前列腺則在膀胱頸背部腹膜下。用1 mL顯微注射器抽取0.10 mL細胞懸液，把細胞吹打均勻，經腹膜進針，一次性注射到前列腺包膜下，且無細胞懸液溢出，前列腺部位立即鼓起1個小包，標志注射成功。棉簽輕微按壓片刻，80號縫線單層縫合，關閉腹腔。本次實驗共種植11只裸鼠，3只由于麻醉及手術意外死亡。

　　1.2.3 高頻彩色多普勒超聲監測 8只裸鼠按照種植先后順序編號為1～8號，第2周至第5周，按順序每周取出2只做高頻彩色多普勒超聲監測。裸鼠采用質量分數0.7%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，使用12～16MHz的超頻探頭對前列腺部位監測。在充盈膀胱的低密度回聲襯托下，清晰顯示出前列腺腫瘤。記錄腫瘤的橫徑與縱徑、腫瘤血流、內部回聲、組織壞死、局部浸潤以及遠處轉移情況。

　　1.2.4 超聲與實際卡尺測量腫瘤的相關性 每次對裸鼠前列腺腫瘤超聲監測時，由2名超聲科大夫分別對同1裸鼠腫瘤橫徑與縱徑分別測量3次完成，并計算出3次測量的平均值。超聲測量完成后在麻醉狀態下解剖裸鼠，開腹顯露前列腺腫瘤，研究者在未知超聲測量結果的情況下，使用游標卡尺測量腫瘤橫徑與縱徑3次，并計算出3次測量的平均值。腫瘤體積計算方式大多數采用[1]，腫瘤體積=短徑2×長徑×0.5236。

　　1.2.5 HE染色 腫瘤組織在1.3 mol?L-1甲醛中固定24 h，石蠟包埋固定并做連續性切片。蘇木素-伊紅染色、顯微鏡下觀察。

　　1.3 統計學處理 計量資料以±s表示。使用SPSS 13.0軟件得出超聲與實際游標卡尺測量腫瘤橫徑的Pearson與Spearman相關系數，超聲與實際游標卡尺測量腫瘤縱徑的Pearson與Spearman相關系數。

　　2 結果

　　2.1 原位模型建立 8只裸鼠于種植后第2周均可觸摸到綠豆大小硬結，質硬、活動度差，裸鼠精神狀態尚佳。以HE染色證實腫瘤是否種植成功，結果表明第8號裸鼠“腫瘤”為囊腫，成瘤率87.5%。當進行相關分析時，采用7只成瘤鼠。

　　2.2 高頻彩色多普勒超聲監測與實際測量結果 8只裸鼠于種植后第2周至第5周，按順序每周取出2只做高頻彩色多普勒超聲監測。7只裸鼠使用超聲測量的橫徑與使用游標卡尺測量的橫徑相比，Pearson與Spearman相關系數分別是0.996(P<0.001)與0.964(P<0.001);7只裸鼠使用超聲測量的橫徑與使用游標卡尺測量的縱徑相比，Pearson與Spearman相關系數分別是0.988(P<0.001)與0.898(P<0.01)。超聲測量與游標卡尺測量呈高度正相關。經超聲測量第6號與第7號裸鼠腫瘤體積分別為(119.9±8.9)mm3與(126.7±9.6)mm3，均>50 mm3，其余4只裸鼠腫瘤體積均<50 mm3，見表1。7只成瘤鼠超聲均在充盈膀胱液性暗區襯托下，于膀胱頸部可清晰地顯示種植腫瘤,腫瘤呈低回聲，邊界清晰。其中4號成瘤鼠超聲測量腫瘤橫徑是2.6 mm，縱徑是2.1 mm。見圖1。該裸鼠前列腺原位種植腫瘤、精囊、膀胱取出在體外的照片，見圖2。表1 裸鼠前列腺原位種植腫瘤使用高頻彩色多普勒超聲與實際游標卡尺測量的結果

　　2.3 HE染色結果 所有成瘤鼠可見個別前列腺樣結構;腫瘤細胞圍繞前列腺腺泡生長，為低分化腺癌結構，腫瘤細胞異形性明顯,極向消失，排列紊亂;胞核大小不一、核大深染,并可見較多核分裂像;有巨核細胞,間質成分少，見圖3。

　　3 討論

　　人前列腺癌動物模型是研究前列腺癌發病機制、腫瘤與宿主關系、癌腫侵襲與轉移過程和治療措施有效性不可缺少的理想實驗工具,裸鼠因其免疫缺陷特性成為建立人類腫瘤動物模型的最佳載體.以往制作前列腺癌裸鼠模型時多選擇皮下作為荷瘤部位,接種方便、易于觀察,但是根據Paget的“種子與土壤”( Seed and Soil)學說,腫瘤的生長和轉移依賴于一個合適的微環境,因此原位種植較皮下接種具有更高的致瘤率，且皮下移植瘤模型并不能很好地模擬前列腺癌在人體內的自然生長過程以及許多生物學行為,而原位種植不僅使腫瘤細胞獲得了更接近人體內的生長微環境,而且其中豐富的內源性生長因子,能夠提高移植成功率,并形成與臨床相似的轉移模式[2]。當今抗腫瘤藥物的臨床前試驗主要使用皮下種植腫瘤，因為皮下種植腫瘤可以方便地使用卡尺測量其直徑或體積，觀察藥物作用的效果。但是前列腺皮下種植腫瘤不可以進行抗血管藥物以及抗轉移性腫瘤藥物的臨床前試驗[3]。

　　在臨床腫瘤的治療中，患者對抗癌藥物治療的效果可以通過腫瘤在影像學上的表現反映出來。近年影像學技術包括超聲、CT、MRI以及一些顯微成像技術發展非常迅速[45]，一些研究者利用MRI可以精確地發現小鼠膀胱內的微小腫瘤，并測量出腫瘤的體積，可以很好地做出縱向監測，但是MRI監測價格昂貴、需要花費很長的時間限制了其在動物實驗中的應用。高頻彩色多普勒超聲由于在技術上的簡便性、非侵襲性、費用低與操作時間短，在鼠類原位種植腫瘤的監測中優于MRI。在前列腺癌動物模型中也有研究者使用經直腸超聲監測[68]，但是需要特殊的腔內小探頭。本次實驗使用經腹部超聲清楚顯示出腫瘤，并可以精確測量腫瘤體積，觀察腫瘤的形態、內部回聲、彩色血流、內部壞死、遠處轉移情況。

　　本次實驗過程中，一裸鼠腫物的高頻彩色多普勒超聲監測發現在膀胱的液性暗區襯托下，疑似原位種植腫瘤。最后HE染色結果是一囊腫。所以高頻彩色多普勒超聲不可以完全確定腫瘤是否種植成功，最后在判斷結果時要以HE染色為標準。

　　在抗腫瘤藥物的臨床前研究中，有2種給藥方式。一種是腫瘤細胞種植當天或稍后給予藥物，稱為腫瘤生長的抑制研究;另一種是當種植腫瘤生長到50～200 mm3給與藥物，稱為腫瘤生長的推遲研究。推遲研究提供的證據優于抑制研究[9]。裸鼠前列腺原位種植腫瘤模型中，當腫瘤生長到體積為50 mm3左右時，也許已經超過該腫瘤的指數增長期，此時將給予藥物容易出現假陽性結果。本次實驗共有5只腫瘤體積在50 mm3以下，7只腫瘤使用超聲與實際卡尺測量均呈高度正向關。說明高頻彩色多普勒超聲可以很好地描述縱向腫瘤的生長情況，尤其在腫瘤生長的早期。本實驗將進一步使用高頻彩色多普勒超聲繪制每只裸鼠前列腺原位種植腫瘤的生長曲線，找出腫瘤的指數生長期或者體積倍增時間，為臨床前抗腫瘤藥物的干預治療提供合適的時間窗。高頻彩色多普勒超聲也可以準確地描述出腫瘤血供、壞死、浸潤、轉移，是一種很好的、非侵襲性的監測工具，也可以應用于轉基因鼠前列腺癌模型的縱向監測。

　　【參考文獻】

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